In Vitro-Generierung von Mausherzfeldspezifischen Herzvorläuferzellen
Summary
Der Zweck dieser Methode ist es, herzfeldspezifische Herzvorläuferzellen in vitro zu erzeugen, um die Vorläuferzellspezifikation und funktionelle Eigenschaften zu untersuchen und kammerspezifische Herzzellen für die Herzkrankheitsmodellierung zu generieren.
Abstract
Pluripotente Stammzellen bieten ein großes Potenzial für das Verständnis von Herzentwicklung und -erkrankungen sowie für die regenerative Medizin. Während die jüngsten Fortschritte in der Entwicklungskardiologie zur Erzeugung von Herzzellen aus pluripotenten Stammzellen geführt haben, ist unklar, ob die beiden Herzfelder – das erste und das zweite Herzfeld (FHF und SHF) – in pluripotenten Stammzellensystemen induziert werden. Um diesem Problem zu begegnen, haben wir ein Protokoll zur In-vitro-Spezifikation und Isolierung herzfeldspezifischer Herzvorläuferzellen erstellt. Wir verwendeten embryonale Stammzellenlinien, die Hcn4-GFP und Tbx1-Cre trugen; Rosa-RFP-Reporter der FHF bzw. der SHF und Live-Zell-Immunostainierung des Zellmembranproteins Cxcr4, einem SHF-Marker. Mit diesem Ansatz erzeugten wir Vorläuferzellen, die die funktionellen Eigenschaften und Transkriptome ihrer In-vivo-Gegenstücke rekapitulieren. Unser Protokoll kann genutzt werden, um die frühe Spezifikation und Segregation der beiden Herzfelder zu untersuchen und kammerspezifische Herzzellen für die Herzkrankheitsmodellierung zu generieren. Da es sich um ein In-vitro-Organoidsystem handelt, liefert es möglicherweise keine genauen anatomischen Informationen. Dieses System überwindet jedoch die schlechte Zugänglichkeit von Embryon im Gastrulationsstadium und kann für Bildschirme mit hohem Durchsatz hochskaliert werden.
Introduction
Die Verwendung von pluripotenten Stammzellen (PSCs) hat den Bereich der Herzregeneration und personalisiertemedizin mit patientenspezifischen Myozyten für die Krankheitsmodellierung und Medikamentierungen1,2,3 , 4. In jüngerer Zeit wurden In-vitro-Protokolle zur Erzeugung von Atrial vs ventrikulären sowie herzschrittmacherartigen PSC-abgeleiteten Kardiomyozyten entwickelt5,6. Ob die Kardiogenese jedoch in vitro neu angelegt werden kann, um die Herzentwicklung zu untersuchen und anschließend ventrikuläre kammerspezifische Herzzellen zu erzeugen, ist noch unklar.
Während der frühen embryonalen Entwicklung bilden mesodermale Zellen unter dem Einfluss von sezernierten Morphogenen wie BMP4, Wnts und Activin A den Primitivstreifen7. Herzmesodermale Zellen, die durch die Expression von Mesp1 gekennzeichnet sind, wandern anterior und später zum Herzhalbmond und dann zum primitiven Herzrohr7,8. Diese Migrationsgruppe umfasst zwei sehr unterschiedliche Populationen von Kardialvorläuferzellen (CPCs), nämlich das erste und das zweite Herzfeld (FHF und SHF)9,10. Zellen aus der SHF sind hoch proliferativ und wandernd und sind in erster Linie für die Dehnung und Schleife des Herzschlauchs verantwortlich. Darüber hinaus unterscheiden sich SHF-Zellen zu Kardiomyozyten, Fibroblasten, glatten Muskel- und Endothelzellen, wenn sie in das Herzrohr eindringen, um den rechten Ventrikel, den rechten ventrikulären Abflusstrakt und einen großen Teil der beiden Atria7,10zu bilden. Im Gegensatz dazu sind FHF-Zellen weniger proliferativ und wandernd und unterscheiden sich hauptsächlich von Kardiomyozyten, da sie den linken Ventrikel und einen kleineren Teil der Vorhöfe11hervorrufen. Darüber hinaus sind SHF-Vorläufer durch die Expression von Tbx1, FGF8, FGF10 und Six2 gekennzeichnet, während FHF-Zellen Hcn4 und Tbx511,12,13,14,15ausdrücken.
PSCs können sich auf alle drei Keimschichten undanschließend auf jeden Zelltyp im Körper 4,16differenzieren. Daher bieten sie ein enormes Potenzial für das Verständnis der Herzentwicklung und für die Modellierung spezifischer Entwicklungsdefekte, die zu angeborenen Herzerkrankungen führen, die häufigste Ursache von Geburtsfehlern17. Eine große Untergruppe der angeborenen Herzerkrankungen umfasst kammerspezifische Herzanomalien18,19. Es ist jedoch noch unklar, ob diese aus der anomalen Herzfeldentwicklung stammen. Darüber hinaus gab es angesichts der Unfähigkeit von Kardiomyozyten, sich nach der Geburt zu vermehren, umfangreiche Bemühungen, Herzgewebe für die Herzregeneration1,7,20zu schaffen. Unter Berücksichtigung der physiologischen und morphologischen Unterschiede zwischen Herzkammern ist die Erzeugung von kammerspezifischem Herzgewebe mit PSCs von erheblicher Bedeutung. Während die jüngsten Fortschritte in der Entwicklungskardiologie zu einer robusten Generierung von Herzzellen aus PSCs geführt haben, ist es immer noch unklar, ob die beiden Herzfelder in PSC-Systemen induziert werden können.
Um die Kardiogenese in vitro zu rekapitulieren und die Spezifikation und die Eigenschaften von CPCs zu untersuchen, haben wir zuvor ein System verwendet, das auf der Differenzierung von PSC-abgeleiteten Herzsphäroiden21,22,23,24basiert. Kürzlich haben wir embryonale Mausstammzellen (mESCs) mit GFP- und RFP-Reportern unter der Kontrolle des FHF-Gens Hcn4 bzw. des SHF-Gens Tbx1 (mESCsTbx1-Cre; Rosa-RFP; HCN4-GFP) 25. In vitro differenzierte mESCs bildeten Herzsphäroide, in denen GFP+- und RFP+-Zellen aus zwei unterschiedlichen Bereichen mesodermaler Zellen auftraten und komplementär gemustert wurden. Die resultierenden GFP+- und RFP+-Zellen wiesen FHF- bzw. SHF-Eigenschaften auf, die durch RNA-Sequenzierung und klonale Analysen bestimmt wurden. Wichtig ist, dass wir mit hilfe von mESCs, die den Isl1-RFP-Reporter (mESCIsl1-RFP)tragen, entdeckt enden, dass SHF-Zellen durch das Zelloberflächenprotein CXCR4 originalgetreu gekennzeichnet sind, was die Isolierung von herzfeldspezifischen Zellen ohne Transgene ermöglichen kann. Das vorliegende Protokoll wird die Erzeugung und Isolierung herzfeldspezifischer CPCs von mESCs beschreiben, die als wertvolles Instrument zur Untersuchung kammerspezifischer Herzkrankheiten dienen können.
Protocol
Representative Results
Discussion
In unserem Protokoll beschreiben wir eine Methodik zur Erzeugung von Herzsphäroiden und isolierten herzfeldspezifischen CPCs. Diese können verwendet werden, um Mechanismen der CPC-Spezifikation und ihre Eigenschaften zu untersuchen, sowie für die herzkammerspezifische Krankheitsmodellierung. Eine zuvor veröffentlichte Arbeit verwendete eine mESC-Linie mit zwei fluoreszierenden Reportern (Mef2c/Nkx2.5), um die Kardiogenese in vitro zu untersuchen, jedoch werden beide Marker am embryonalen Tag 9.5-10 exprimiert, wenn K…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
E. T. wurde von The Magic That Matters und AHA unterstützt. C. K. wurde durch Zuschüsse von NICHD/NIH (R01HD086026), AHA und MSCRF unterstützt.
Materials
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| 0.1% (w/v) Gelatin | EMD Millipore | ES-006-B | |
| 100mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 | |
| 100X Pen/Strep | Gibco | 15070-063 | |
| 1X PBS w/o Calcium and Magnesium | Thermo Fisher Scientific | 21-040-CV | |
| 20% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 50-980-493 | |
| 5 ml Polystyrene round-bottom tube with a 40μm cell strainer | BD Falcon | 35223 | |
| Activin A | R & D Systems | 338-AC-010 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A-4544 | |
| B27 minus vitamin A (50x) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| BMP4 | R & D Systems | 314-BP | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| Cell sorter | Sony | SH800 | Sony or any other fluorescence-activated cell sorter |
| Cell strainer 70μm | Thermo Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Centrifuge Sorvall Legend XT | Thermo Fisher Scientific | 75004508 | |
| CHIR99021 | Selleck chemicals | S2924 | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51030285 | |
| Corning Ultra Low Attachment T75 flask | Corning | 07-200-875 | |
| Countless II FL automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | ||
| Donkey anti-mouse IgG secondary antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-31571, Lot #1757130 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium high glucose (DMEM) | Gibco | 11965-092 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| ESGRO (LIF) | Millipore | ESG1106 | |
| EVOS FL microscope | Thermo Fisher Scientific | AMF4300 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | SH30071.03 | |
| Glasgow’s MEM (GMEM) | Gibco | 11710035 | |
| GlutaMAX (100 x) | Gibco | 35050-061 | |
| Ham’s F12 | Gibco | 10-080-CV | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Monothioglycero (MTG) | Sigma | M-6145 | |
| Mouse anti-Troponin T antibody | Thermo Fisher Scientific | MS-295-P1 | |
| N2-SUPPLEMENT | Gibco | 17502-048 | |
| Non-essential amino acid solution (NEAA | Invitrogen | 11140-050 | |
| PD0325901 | Selleckchem | S1036 | |
| PerCP-efluor 710 conjugated anti-Cxcr4 antibody | Thermo Fisher Scientific | 46-9991-82 | |
| Suspension culture dish 150 mm x 25mm | Corning | 430597 | |
| T25 flasks | Corning | 353109 | |
| TrypLE (Trypsin) | Gibco | 12604 | |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) | Stem cell technologies | 72304 |
References
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