Murina modeller av åderförkalkning är användbara verktyg för att undersöka patogena vägar på molekylär nivå, men kräver standardiserad kvantifiering av lesion utveckling. Detta protokoll beskriver en optimerad metod för att bestämma lesion storlek i de stora arteriella fartyg inklusive aorta roten, aortabågen, och brachiocephalic artär.
Hjärt-kärlsjukdom är den främsta dödsorsaken i världen. Den bakomliggande orsaken i de flesta fall är åderförkalkning, som delvis är en kronisk inflammatorisk sjukdom. Experimentella studier av åderförkalkning har belyst betydelsen av kolesterol och inflammation i sjukdomsprocessen. Detta har lett till framgångsrika kliniska prövningar med farmaceutiska agenter som minskar kliniska manifestationer av åderförkalkning. Noggranna och välkontrollerade experiment i musmodeller av sjukdomen kan ytterligare belysa patogenesen av sjukdomen, som inte är helt klarlagd. Standardiserad lesionsanalys är viktigt för att minska experimentell variation och öka reproducerbarheten. Bestämma lesion storlek i aorta roten, aortabågen, och brachiocephalic artär är vanliga endpoints i experimentell åderförkalkning. Detta protokoll ger en teknisk beskrivning för utvärdering av åderförkalkning på alla dessa platser i en enda mus. Protokollet är särskilt användbart när materialet är begränsat, vilket ofta är fallet när genetiskt modifierade djur karaktäriseras.
Hjärt-kärlsjukdom är den främsta dödsorsaken i världen med ischemisk hjärtsjukdom och stroke redovisning för en av varje fyra dödsfall1. De flesta fall orsakas av åderförkalkning, en sjukdom som kännetecknas av en långsam ansamling av lipidbelastade plack med tecken på kronisk inflammation i stora och medelstora artärer2. Sjukdomen är oftast obemärkt under flera decennier tills en bristning eller erosion av plack framkallar en arteriell trombos som leder till ischemisk vävnadsskada.
En normal artär består av ett intima skikt med endotelceller och glest fördelade glatta muskelceller, ett media skikt med släta muskelceller och elastiska lamellerna, och en omgivande adventitial skikt med lös bindväv3. En intimial retention av LDL kompenserar åderförkalkning utveckling4. Ackumulering och modifiering av lipoproteiner leda till aggregering och Entrapment inom arteriell intima5. Ett inflammatoriskt svar framkallas av de fångade och modifierade Lipoproteinerna6. Endotelceller börjar uttrycka adhesionsmolekyler, såsom VCAM-1 på platser i arteriella träd med turbulent blodflöde, vilket leder till rekrytering av cirkulerande monocyter och andra leukocyter7. De ininfiltrerande monocyterna gör åtskillnad mellan in i makrofager det uppsluka lipid med efterföljande omformning till makrofag skumma celler8.
Åderförkalkning har studerats i musmodeller med ökande frekvens sedan mitten av 1980-talet. C57BL/6 är den mest använda inavlade mus stammen för dessa studier, och det används som genetisk bakgrund för de flesta genetiskt modifierade stammar9. Denna stam etablerades i 1920-talet10, och dess arvsmassa publicerades i 200211. Experiment i musmodeller har flera fördelar: kolonierna återger snabbt, bostäder är utrymmeseffektiva och inavel minskar experimentell variation. Modellen möjliggör också genetiska manipulationer, såsom riktade genborttagningar och införande av transgener. Detta har lett till ny patofysiologisk förståelse av sjukdomen och nya terapimål12.
Wild-Type C57BL/6 möss är naturligt resistenta mot åderförkalkning. De har de flesta av de cirkulerande kolesterolet i HDL, och komplexa aterosklerotiska lesioner bildas inte ens när matas en fettrik och hög-kolesterol diet13. Hyperkolesterolemiska möss, såsom APOE-/- på C57BL/6-bakgrunden, används därför som experimentella modeller av åderförkalkning14,15. Avsaknaden av ApoE försämrar hepatiska upptaget av rester lipoproteiner och kraftigt perturbs lipid metabolism. I APOE-/- möss, cirkulerande kolesterol är främst i VLDL partiklar, och möss utveckla komplexa aterosklerotiska plack på en regelbunden Chow diet.
Ldlr-/- möss imiterar utvecklingen av åderförkalkning ses hos människor med familjär hyperkolesterolemi16. Den ldlr-/- möss behöver en västerländsk typ diet för att utveckla åderförkalkning17. Västerländsk diet härmar mänskligt födointag och innehåller vanligtvis 0,15% kolesterol. LDL-receptorn känner igen ApoB100 och ApoE och förmedlar upptaget av LDL-partiklar genom endocytos. LDL-receptorer är grundläggande för leverclearance av LDL från cirkulationen, medan LDL-receptoruttryck i hematopoietiska celler inte påverkar denna process. Detta öppnar möjligheten för benmärgstransplantation av ldlr+/+ celler till hyperkolesterolemiska ldlr-/- mottagare och bedömning av åderförkalkning utveckling. Benmärgs chimärer har ofta använts för att studera deltagande av hematopoietiska celler i experimentell åderförkalkning. Benmärgstransplantation kan dock påverka storleken och sammansättningen av aterosklerotiska plack, vilket gör tolkningen av resultaten tvetydig.
Olika varianter av APOE-/- och ldlr-/- möss med ytterligare genetiska förändringar har utvecklats för att studera specifika processer av sjukdomen18. Ett exempel är human APOB100-transgena ldlr-/- (hubl) möss som bär den fullängds mänskliga APOB100 genen19,20. Dessa möss utveckla hyperkolesterolemi och åderförkalkning på en regelbunden Chow diet. Emellertid, utvecklingen av komplexa aterosklerotiska plack tar minst sex månader och kortare experimentella protokoll brukar använda västerländska diet21. En stor del av plasmakolesterolet cirkulerar i LDL-partiklar, vilket ger hubl möss en mer människoliknande dyslipidemi lipoprotein profil jämfört med APOE-/- och ldlr-/- möss. Hubl möss tillåter också studier av Human ApoB som autoantigenet22.
Mus modellerna av åderförkalkning utveckla komplexa aterosklerotiska plack med gemensamma egenskaper hos mänskliga sjukdomar. Emellertid, plack är ganska resistenta mot bristning med efterföljande hjärtinfarkt. Atherothrombosis är endast sporadiskt upptäcks och experimentellt utmanande att bedöma23,24,25. Särskilda modeller av plack ruptur har utvecklats, men försöksområdet saknar en tillförlitlig och reproducerbar modell för bedömning av plack stabiliserande medel.
Kvantifiering av åderförkalkning har rapporterats på många sätt i litteraturen. De senaste insatserna har försökt standardisera experimentell design, utförande och rapportering av djurstudier26. Utredarna har olika preferenser och tekniker anpassade till sina laboratorier. De flesta forskningsprojekt är också unika på ett sätt som kräver vissa protokoll ändringar. På grund av sjukdomens mångfaktoriella karaktär varierar de optimala kontrollerna mellan projekten. Lokala förhållanden och bristande standardisering kan orsaka observerade skillnader i sjukdomsutveckling, vilket hämmar framstegen inom forskningsområdet. Skillnader i experimentell variation innebär också att statistiska effektberäkningar måste baseras på pilotstudier under lokala förhållanden.
Kvantifiering av åderförkalkning rekommenderas på flera ställen i kärl trädet. Detta protokoll beskriver hur man får resultat från aorta roten, aortabågen, och brachiocephalic artären i en enda mus, förutom att lämna resten av thoracoabdominella aorta för andra analyser. En Face preparat möjliggör snabb kvantifiering av lipidbelastade plack i aortabågen. Sjukdomsbördan i brachiocephalic artären kan också kvantifieras om proverna är noggrant visas. Ju mer tidskrävande tvärsnittning av aorta roten lämnar flera sektioner tillgängliga för detaljerad utvärdering av plack sammansättning.
Hjärt-kärlsjukdom är den främsta mördaren i världen och nya förebyggande mätningar behövs2. Musmodeller av sjukdomen ger en omfattande plattform för utredning av patofysiologi och experimentella behandlingar13. Kvantifiering av tillförlitlig lesionsstorlek är avgörande för denna metod. Kvantifieringsmetoderna skiljer sig dock åt mellan laboratorierna. Standardisering och optimering har varit en pågående process sedan 1980-talet13,27,33,34. Aorta rötter har dykt upp som den mest populära platsen för att kvantifiera experimentell åderförkalkning. Tvärsnitt av plack möjliggör jämförelse av plack volym mellan grupper. En Face preparat gynnas för lesion kvantifiering i större segment av aorta. En Face-metoden visualiserar plack kvantitet och möjliggör kvantifiering av plack område täckning, men inte ta plack tjocklek i konto. Den biologiska relevansen för observerade skillnader motiveras av sammanhängande resultat på olika platser i det vaskulära trädet. Utvärdera åderförkalkning utveckling på olika platser adresser möjliga platsspecifika effekter. Effekten av transplanterade hematopoietiska celler på åderförkalkning utveckling kan bedömas i hyperkolesterolemisk ldlr-/- chimärer. Men hela kroppen bestrålning påverkar åderförkalkning processen med platsspecifika effekter. Mer framträdande aterosklerotiska lesioner utvecklas i aorta roten, medan minskad lesion utveckling observeras i aorta Arches35.
Viktigt, inte bara lesion storlek behöver åtgärdas i studier av experimentell åderförkalkning. Lesion sammansättning är också en viktig parameter. Flera plack funktioner har förknippats med manifestationer av sjukdomen hos människor36. Seriell snittning av aorta roten lämnar flera sektioner tillgängliga för noggrann analys av plack sammansättning. Plack ruptur hos människor kännetecknas av en tunn fibrös mössa med få glatta muskelceller, glesa kollagen innehåll och tecken på inflammation i plack36. Även plack ruptur är en sällsynt händelse i musmodeller av åderförkalkning, markörer för plack stabilitet är informativa att utvärdera. Translationella tillvägagångssätt kan bekräfta mekanistiska resultat från musmodeller och avslöja viktiga egenskaper hos mänskliga sjukdomar31. Inflammatoriska status av aterosklerotiska plack kan bestämmas genom immunohistokemi färgning av VCAM-1, MHC klass II, makrofager, och lymfocyter30. Vissa protokoll använder längsgående sektioner i koronala planet i aortabågen eller brachiocephalic artär för att mäta aterosklerotisk lesion storlek och sammansättning37. Emellertid, denna alternativa metod lämnar endast få delar som ska analyseras, som begränsar dess applikationer.
Ett initialt kritiskt steg i detta protokoll är förmågan att skörda artärer effektivt. Hand-öga-koordination under mikroskopet kräver övning och är avgörande både för microdissection och den efterföljande fastlåsning av aortabågen. Nästa kritiska steg i detta protokoll är insamling av seriella sektioner från aorta roten. 80 sammanhängande avsnitt ska samlas in för varje mus, vilket kräver både fokus och tålamod. Metodiska färdigheter skulle kunna påskynda de beskrivna processerna avsevärt. Ändå, aterosklerotisk lesion kvantifiering är fortfarande en tidskrävande uppgift. Ny teknik, automatiserad hantering och smådjur avbildning kan underlätta kvantifiering av experimentell åderförkalkning i framtiden. Utvecklingen av åderförkalkning är långsam och de flesta experimentella protokoll i musmodeller tar mer än fyra månader att slutföra13. Därför måste artärer samlas in på ett optimerat sätt vid studieslut punkter. Detta protokoll ger en omfattande guide till skörd artärer effektivt och den föreslagna bearbetningen förbereder artärer för multi-purpose användning inklusive lesion kvantifiering i aorta roten, aortabågen, och brachiocephalic artär. Förhoppningsvis protokollet kan minska experimentell variation, förbättra tillförlitligheten i resultaten, och leda till resultat som kommer att bana väg för nya behandlingar mot åderförkalkning.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar alla tidigare medlemmar i Göran K Hanssons experimentella kardiovaskulära forskningsenhet som hjälpte till att utveckla detta protokoll under det senaste kvarts århundradet. Vi är särskilt tacksamma för bidragen från Antonino Nicoletti, Xinghua Zhou, Anna-Karin Robertson och Inger Bodin. Detta arbete stöddes av projekt Grant 06816 och Linnéstöd 349-2007-8703 från Vetenskapsrådet, samt av bidrag från hjärt-Lungstiftelsen, Stockholms läns landsting, professor Nanna Svartz stiftelse, Loo och hans Osterman Stiftelsen för medicinsk forskning, Karolinska Institutets forskningsstiftelse och Stiftelsen för geriatriska sjukdomar vid Karolinska Institutet.
Acetone | VWR Chemicals | 20066.296 | For fixation of sections for immunohistochemistry. |
Black electrical insulation tape (50 mm wide) | Any specialized retailer | – | To create pinning beds for aortic arches. |
Centrifuge | Eppendorf | 5417C | Benchtop microcentrifuge. |
Cork board | Any specialized retailer | – | For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots. |
Cryostat | Thermo Scientific | Microm HM 560 | For serial cryosectioning of aortic roots. |
Deionized water | – | – | For rinsing and preparation of solutions. |
Digital camera | Leica Microsystems | DC480 | 5.1 megapixel CCD for high-resolution images of aortic arches and aortic root sections. |
Dissecting scissors (10 cm, straight) | World Precision Instruments | 14393 | For general dissection of organs. |
Dumont forceps #5 (11 cm, straight) | World Precision Instruments | 500341 | For microdissection of aorta. |
Ethanol 70% (v/v) | VWR Chemicals | 83801.290 | Highly flammable liquid and vapour, store in a well-ventilated place, and keep cool. |
Ethanol absolute ≥99.8% | VWR Chemicals | 20821.310 | Highly flammable liquid and vapour, store in a well-ventilated place, and keep cool. |
Formaldehyde 4% stabilised, buffered (pH 7.0) | VWR Chemicals | 9713.1000 | Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. |
ImageJ | NIH | – | Image analysis software. |
Iris forceps (10 cm, curved, serrated) | World Precision Instruments | 15915-G | Used as anatomical forceps. |
Isopropanol | Merck | 1096341011 | Flammable liquid, causes serious eye irritation, and may cause drowsiness or dizziness. |
Kaiser's glycerol gelatine | Merck | 1092420100 | Aqueous mounting medium containing phenol. Suspected of causing genetic defects. |
Light microscope | Leica Microsystems | DM LB2 | For analysis during sectioning and documentation of Oil Red O stained micrographs. |
Mayer's hematoxylin | Histolab | 1820 | Non-toxic staining solution without chloral hydrate, but causes serious eye irritation. |
Mayo scissors (17 cm, straight) | World Precision Instruments | 501751-G | For general dissection. |
Micro Castroviejo needle holder (9 cm, straight) | World Precision Instruments | 503376 | For pinning of aortic arches. |
Microcentrifuge tubes | Corning | MCT-175-C | Polypropylene microtubes with snaplock cap. |
Microlance 3 needles, 23 gauge | BD | 300800 | For blood collection. |
Microlance 3 needles, 27 gauge | BD | 302200 | For perfusion of mice. |
Microvette 500 µL, K3 EDTA | Sarstedt | 20.1341.100 | For blood collection. |
Microvette 500 µL, Lithium Heparin | Sarstedt | 20.1345.100 | For blood collection. |
Minutien insect pins, 0.10 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | For pinning of aortic arches. |
Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | Not classified as a hazardous substance or mixture. |
Optimum cutting temperature (OCT) cryomount | Histolab | 45830 | For embedding tissue. |
Parafilm M | Bemis | PM992 | Paraffin wax film used to create pinning beds for aortic arches. |
Petri dishes (100×20 mm) | Any cell culture supplier | – | Proposed as a storage container for pinned aortas. |
Phosphate buffered saline (PBS) | – | – | Sterile and RNase-free solution is required for perfusion of mice. |
Qualitative filter paper (grade 1001) | Munktell | 120006 | For filtering Oil Red O working solution (typical retention 2-3 µm). |
RNAlater RNA stabilization reagent | Qiagen | 76106 | For stabilization of RNA in tissue samples |
RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | A surface decontamination solution that destroys RNases on contact. |
Scalpel handle #3 (13 cm) | World Precision Instruments | 500236 | For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots. |
Standard scalpel blade #10 | World Precision Instruments | 500239 | For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots. |
Stereomicroscope | Leica Microsystems | MZ6 | For dissection and en face documentation |
Sudan IV | Sigma-Aldrich | S4261 | Not classified as a hazardous substance or mixture. |
Superfrost Plus microscope slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | To collect aortic root sections. |
Tissue forceps (15 cm) | World Precision Instruments | 501741-G | For general dissection. |
Tissue-Tek cryomolds (10x10x5 mm) | Sakura | 4565 | For embedding aortic roots in OCT. |
Vannas scissors (8 cm, straight) | World Precision Instruments | 503378 | For microdissection of aorta. |