Analisi biochimiche in Vitro che utilizzano etichette di biotina per studiare le interazioni proteina-nucleica dell'acido
Summary
Qui sono presentati protocolli per saggi biochimici in vitro utilizzando etichette di biotina che possono essere ampiamente applicabili per studiare le interazioni proteina-nucleiche dell’acido.
Abstract
Le interazioni tra acido proteina-nucleico svolgono un ruolo importante nei processi biologici come la trascrizione, la ricombinazione e il metabolismo dell’RNA. I metodi sperimentali per studiare le interazioni tra proteine-nucleici con acido richiedono l’uso di tag fluorescenti, isotopi radioattivi o altre etichette per rilevare e analizzare molecole bersaglio specifiche. La biotina, un’etichetta di acido nucleico non radioattivo, è comunemente usata nei saggi di mobilità elettroforici (EMSA), ma non è stata regolarmente impiegata per monitorare l’attività delle proteine durante i processi dell’acido nucleico. Questo protocollo illustra l’utilità dell’etichettatura della biotina durante le reazioni enzimatiche in vitro, dimostrando che questa etichetta funziona bene con una serie di diversi saggi biochimici. In particolare, in linea con i precedenti risultati ottenuti utilizzando substrati con etichetta a radioisotopi 32P, è confermato tramite EMSA con etichetta biotina che IL MEIOB (una proteina specificamente coinvolta nella ricombinazione meiotica) è una proteina legante al DNA, che MOV10 (un RNA helicase) risolve le strutture in base al polpa di RNA etichettate con biotina, e quel MEIOB fende il DNA a filamento singolo etichettato con biotina. Questo studio dimostra che la biotina è in grado di sostituendo 32P in vari saggi biochimici correlati all’acido nucleico in vitro.
Introduction
Le interazioni tra acido proteina-nucleico sono coinvolte in molti processi cellulari essenziali come la riparazione del DNA, la replicazione, la trascrizione, l’elaborazione dell’RNA e la traduzione. Le interazioni proteiche con sequenze specifiche di DNA all’interno della cromatina sono necessarie per uno stretto controllo dell’espressione genica a livello tracscrivionale1. Una precisa regolazione posttrapescrittiva di numerosi RNA codificanti e non codificanti richiede interazioni estese e complicate tra qualsiasi proteina e RNA2. Questi strati del meccanismo regolatore dell’espressione genica comprendono una cascata di eventi intermolecolari dinamici, coordinati da interazioni di trancilazione/fattori epigenetici o proteine che legano l’RNA con i loro bersagli di acido nucleico, nonché interazioni proteina-proteina. Per sezionare se le proteine in vivo sono direttamente o indirettamente associate agli acidi nucleici e come tali associazioni si verificano e culminano, vengono condotte analisi biochimiche in vitro per esaminare l’affinità legante o l’attività enzimatica delle proteine di interesse sussidi progettati di DNA e/o RNA.
Sono state sviluppate molte tecniche per rilevare e caratterizzare i complessi nucleo-acido-proteina, tra cui l’analisi elettroforetica della mobilità (EMSA), chiamata anche analisi del ritardo del gel o analisi dello spostamento della banda3,4,5 . L’EMSA è un metodo biochimico versatile e sensibile che è ampiamente utilizzato per studiare il legame diretto delle proteine con gli acidi nucleici. L’EMSA si basa sullo spostamento elettroforetico del gel nelle bande, che vengono regolarmente visualizzate utilizzando la chemiluminescenza per rilevare le etichette di biotina6,7, la fluorescenza delle etichette fluoroforiche8,9o autoradiografia delle etichette radioattive 32P10,11. Altri scopi degli studi biochimici sono l’identificazione e la caratterizzazione dell’attività di elaborazione dell’acido nucleico delle proteine, come le reazioni basate sulla nuclea per valutare i prodotti di scissione da substrati di acido nucleico12, 13 del sistema , 14 e analisi di rimozione della struttura del DNA/RNA per valutare le attività elicasise15,16,17.
In questi saggi di attività enzimatica, gli acidi nucleici etichettati al radioisotolo o al fluoroforo sono spesso utilizzati come substrati a causa della loro elevata sensibilità. L’analisi delle radiografie delle reazioni enzimatiche che coinvolgono radiotracciatori con etichetta 32P è risultata sensibile e riproducibile18. Tuttavia, in un numero crescente di laboratori nel mondo, l’uso di radioisotopi è limitato o addirittura vietato a causa dei rischi per la salute associati alla potenziale esposizione. Oltre ai problemi di biosicurezza, altri inconvenienti sono l’attrezzatura necessaria per condurre il lavoro con i radioisotopi, la licenza di radioattività richiesta, l’emivita breve di 32P (circa 14 giorni) e il graduale deterioramento della qualità della sonda a causa radiolisi. Pertanto, sono stati sviluppati metodi alternativi non isotopici (cioè, l’etichettatura della sonda con fluorofori consente il rilevamento mediante imaging fluorescente19). Tuttavia, quando si utilizzano sonde con etichetta fluorescente, è necessario un sistema di imaging ad alta risoluzione. La biotina, un’etichetta comunemente usata, si lega prontamente alle macromolecole biologiche come proteine e acidi nucleici. Il sistema Biotin-streptavidin funziona in modo efficiente e migliora la sensibilità di rilevamento senza aumentare lo sfondo non specifico20,21. Oltre all’EMSA, la biotina è ampiamente utilizzata per la purificazione delle proteine e l’RNA pull-down, tra gli altri22,23,24.
Questo protocollo utilizza con successo gli acidi nucleici etichettati con biotina come substrati per analisi biochimiche in vitro che includono EMSA, oltre a reazioni enzimatiche in cui la biotina non è stata comunemente utilizzata. Il dominio MEIOB OB è costruito e due mutanti (troncamento e mutazione puntiforme) sono espressi come proteine di fusione GST25,26,27, così come il topo MOV10 ricombinante proteina di fusione FLAG16. La relazione mette in evidenza l’efficacia di questo protocollo combinato per la purificazione delle proteine e i saggi etichettati con biotina per vari scopi sperimentali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lo studio delle interazioni tra proteine e acidi nucleici è fondamentale per la nostra comprensione dei meccanismi molecolari alla base di diversi processi biologici. Ad esempio, MEIOB è una proteina specifica per i testicoli essenziale per la meiosi e la fertilità nei mammiferi25,26,27. MEIOB contiene un dominio OB che si lega al DNA a filamento singolo e presenta da 3′ a 5′ attività esonuclease26, c…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo P. Jeremy Wang (Università della Pennsylvania) per modifiche e discussioni utili. Ringraziamo anche Sigrid Eckardt per l’editing linguistico. È stato sostenuto dal Programma nazionale di Ricerca e Sviluppo della Cina (2016YFA0500902, 2018YFC1003500) e dalla National Natural Science Foundation of China (31771653). L. Y. è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (81471502, 31871503) e dal Programma Innovativo e Imprenditoriale della Provincia di Jiangsu. J. N. è stato supportato dal progetto di scienza e tecnologia medica di zhejiang (2019KY499). M. L. è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (31771588) e del 1000 Youth Talent Plan.
Materials
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5242R | |
| Chemiluminescent Imaging System | Tanon, China | 5200 | |
| Digital sonifer | Branson, USA | BBV12081048A | 450 Watts; 50/60 HZ |
| Semi-dry electrophoretic blotter | Hoefer, USA | TE77XP | |
| Tube Revolver | Crystal, USA | 3406051 | |
| UV-light cross-linker | UVP, USA | CL-1000 | |
| Materials | |||
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter | Milipore, USA | UFC801096 | 4 ml/10 K |
| Nylon membrane | Thermo Scientific, USA | TG263940A | |
| TC-treated Culture Dish | Corning, USA | 430167 | 100 mm |
| TC-treated Culture Dish | Corning, USA | 430597 | 150 mm |
| Microtubes tubes | AXYGEN, USA | MCT-150-C | 1.5 mL |
| Tubes | Corning, USA | 430791 | 15 mL |
| Reagents | |||
| Ampicillin | SunShine Bio, China | 8h288h28 | |
| Anti-FLAG M2 magnetic beads | Sigma, USA | M8823 | |
| ATP | Thermo Scientific, USA | 591136 | |
| BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit | Beyotime, China | C3206 | |
| CelLyticTM M Cell Lysis Reagent | Sigma, USA | 107M4071V | |
| ClonExpress II one step cloning kit | Vazyme, China | C112 | |
| Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Kit | Thermo Scientific, USA | T1269950 | |
| dNTP | Sigma-Aldrich, USA | DNTP100-1KT | |
| DMEM | Gibco, USA | 10569044 | |
| DPBS buffer | Gibco, USA | 14190-136 | |
| EDTA | Invitrogen, USA | AM9260G | 0.5 M |
| EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche, USA | 04693132001 | |
| EndoFree Maxi Plasmid Kit | Vazyme, China | DC202 |
|
| FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit | Vazyme, China | DC301-01 | |
| FBS | Gibco, USA | 10437028 | |
| FLAG peptide | Sigma, USA | F4799 | |
| Glycerol | Sigma, USA | SHBK3676 | |
| GST Bulk Kit | GE Healthcare, USA | 27-4570-01 | |
| HEPES buffer | Sigma, USA | SLBZ2837 | 1 M |
| IPTG | Thermo Scientific, USA | 34060 | |
| KoAc | Sangon Biotech, China | 127-08-02 | |
| Lipofectamin 3000 Transfection Reagent | Thermo Scientific, USA | L3000001 | |
| MgCl2 | Invitrogen, USA | AM9530G | 1 M |
| NaCl | Invitrogen, USA | AM9759 |
5 M |
| NP-40 | Amresco, USA | M158-500ML | |
| Opti-MEM medium | Gibco, USA | 31985062 | |
| PBS | Gibco, USA | 10010023 | PH 7.4 |
| RNase Inhibitor | Promega, USA | N251B | |
| Streptavidin alkaline phosphatase | Promega, USA | V5591 | |
| TBE | Invitrogen, USA | 15581044 | |
| Tris-HCI Buffer | Invitrogen, USA | 15567027 | 1 M, PH 7.4 |
| Tris-HCI Buffer | Invitrogen, USA | 15568025 | 1 M, PH 8.0 |
| Tween-20 | Sangon Biotech, China | A600560 |
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