In vitro biochemische assays met behulp van biotine etiketten om eiwit-nucleïnezuur interacties te bestuderen
Summary
Hier zijn de protocollen voor in vitro biochemische assays met behulp van biotine etiketten die algemeen toepasbaar voor het bestuderen van eiwit-nucleïnezuur interacties.
Abstract
Eiwit-nucleïnezuur interacties spelen belangrijke rollen in biologische processen zoals transcriptie, recombinatie, en RNA metabolisme. Experimentele methoden om eiwit-nucleïnezuur interacties te bestuderen vereisen het gebruik van fluorescerende Tags, radioactieve isotopen of andere etiketten om specifieke doel moleculen te detecteren en te analyseren. Biotine, een niet-radioactieve nucleïnezuur label, wordt vaak gebruikt in elektroforetisch mobiliteits verschuiving assays (EMSA) maar is niet regelmatig toegepast om te controleren van de eiwit activiteit tijdens nucleïnezuur processen. Dit protocol illustreert het nut van biotine labeling tijdens in vitro enzymatische reacties, waaruit blijkt dat dit label goed werkt met een scala aan verschillende biochemische assays. Specifiek, in afstemming met eerdere bevindingen met behulp van radio-isotopen 32P-gelabelde substraten, wordt bevestigd via Biotine-gelabeld EMSA dat MEIOB (een eiwit dat specifiek bij de Meiotische recombinatie betrokken is) een DNA-bindend eiwit is, dat MOV10 (een RNA Helicase) lost biotin-gelabelde RNA-duplex structuren op, en dat MEIOB het Biotine-gelabelde enkel-streng DNA. Deze studie toont aan dat Biotine in staat is om 32P in verschillende biochemische assays in nucleïnezuur in vitro te vervangen.
Introduction
Eiwit-nucleïnezuur interacties zijn betrokken bij vele essentiële cellulaire processen zoals DNA-herstel, replicatie, transcriptie, RNA-verwerking, en vertaling. Eiwit interacties met specifieke DNA-sequenties binnen de chromatine zijn nodig voor de strakke controle van genexpressie op het transcriptionele niveau1. Precieze posttranscriptionele regulering van talrijke Codeer-en niet-Codeer Rna’s vereist uitgebreide en gecompliceerde interacties tussen elk eiwit en RNA2. Deze lagen van genexpressie regelgevingsmechanisme omvatten een cascade van dynamische intermoleculaire gebeurtenissen, die worden gecoördineerd door interacties van transcriptie/epigenetische factoren of RNA-bindende eiwitten met hun nucleïnezuur doelen, evenals eiwit-eiwit interacties. Om te ontleden of eiwitten in vivo direct of indirect geassocieerd zijn met nucleïnezuren en hoe dergelijke associaties zich voordoen en culmineren, worden in vitro biochemische assays uitgevoerd om de bindende affiniteit of enzymatische activiteit van eiwitten van belang te onderzoeken op ontworpen substraten van DNA en/of RNA.
Er zijn veel technieken ontwikkeld om nucleïnezuur-eiwitcomplexen op te sporen en te karakteriseren, waaronder de elektroforetisch mobiliteits verschuiving test (EMSA), ook wel gel retardatie assay of band Shift assay3,4,5 . EMSA is een veelzijdige en gevoelige biochemische methode die op grote schaal wordt gebruikt voor het bestuderen van de directe binding van eiwitten met nucleïnezuren. EMSA vertrouwt op gel elektrofortische verschuiving in banden, die routinematig worden gevisualiseerd met behulp van chemiluminescentie om Biotine-etiketten op te sporen6,7, de fluorescentie van de-etiketten8,9, of door autoradiografie van radioactieve 32P-etiketten10,11. Andere doeleinden van biochemische studies zijn de identificatie en karakterisering van de nucleïnezuur-verwerkingsactiviteit van eiwitten, zoals Nuclease-gebaseerde reacties om de splijting producten te beoordelen uit nucleïnezuur substraten12, 13 , 14 en DNA/RNA structuur-ontwikkeling assays om Helicase activiteiten te evalueren15,16,17.
In dergelijke enzymatische activiteit testen, de radioisotope-gelabelde of fluorophore-gelabelde nucleïnezuren worden vaak gebruikt als substraten vanwege hun hoge gevoeligheid. Analyse van radiografen van enzymatische reacties met betrekking tot 32P gelabelde radiotracers bleken gevoelig en reproduceerbaar18. Maar in een toenemend aantal laboratoria in de wereld, het gebruik van radio-isotopen is beperkt of zelfs verboden als gevolg van de gezondheidsrisico’s die gepaard gaan met potentiële blootstelling. Naast bioveiligheid zorgen, andere nadelen zijn de vereiste noodzakelijke apparatuur om te werken met radio-isotopen, vereiste radioactiviteit licentie, korte halfwaardetijd van 32P (over 14 dagen), en geleidelijke verslechtering van de kwaliteit van de sonde als gevolg van Radiolyse. Er zijn dus alternatieve niet-isotopic methoden ontwikkeld (d.w.z. het labelen van de sonde met fluoroforen maakt detectie mogelijk door fluorescerende beeldvorming19). Een beeldvormings systeem met hoge resolutie is echter nodig bij het gebruik van fluorescently gelabelde sondes. Biotine, een veelgebruikt etiket, bindt gemakkelijk aan biologische macromoleculen zoals eiwitten en nucleïnezuren. Het biotin-streptavidin-systeem werkt efficiënt en verbetert de detectiegevoeligheid zonder de niet-specifieke achtergrond20,21te verhogen. Naast EMSA wordt Biotine veel gebruikt voor de eiwit zuivering en de pull-down van RNA, onder andere22,23,24.
Dit protocol gebruikt met succes Biotine gelabelde nucleïnezuren als substraten voor in vitro biochemische testen, waaronder EMSA, naast enzymatische reacties waarin Biotine niet vaak is gebruikt. De meiob ob domein is geconstrueerd en twee mutanten (truncation en Point mutatie) worden uitgedrukt als gst Fusion eiwitten25,26,27, evenals muis MOV10 recombinant Flag Fusion proteïne16. Dit verslag belicht de effectiviteit van dit gecombineerde protocol voor eiwit zuivering en biotine gelabelde assays voor diverse experimentele doeleinden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Onderzoek naar eiwit-nucleïnezuur interacties is van cruciaal belang voor ons begrip van moleculaire mechanismen onderliggende diverse biologische processen. Meiob is bijvoorbeeld een testis-specifiek eiwit dat essentieel is voor meiose en vruchtbaarheid bij zoogdieren25,26,27. MEIOB bevat een OB-domein dat bindt aan single-streng DNA en vertoont 3 ‘ tot 5 ‘ exonuclease activiteit26, die rechtstreeks bet…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken P. Jeremy Wang (University of Pennsylvania) voor nuttige bewerkingen en discussies. We danken ook Sigrid Eckardt voor taal bewerking. K. Z. werd ondersteund door National key R & D programma van China (2016YFA0500902, 2018YFC1003500) en National Natural Science Foundation of China (31771653). L. Y. werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (81471502, 31871503) en het innovatieve en ondernemende programma van de provincie Jiangsu. J. N. werd gesteund door het Zhejiang Medical Science and Technology project (2019KY499). M. L. werd gesteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (31771588) en het 1000 Youth talent plan.
Materials
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5242R | |
| Chemiluminescent Imaging System | Tanon, China | 5200 | |
| Digital sonifer | Branson, USA | BBV12081048A | 450 Watts; 50/60 HZ |
| Semi-dry electrophoretic blotter | Hoefer, USA | TE77XP | |
| Tube Revolver | Crystal, USA | 3406051 | |
| UV-light cross-linker | UVP, USA | CL-1000 | |
| Materials | |||
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter | Milipore, USA | UFC801096 | 4 ml/10 K |
| Nylon membrane | Thermo Scientific, USA | TG263940A | |
| TC-treated Culture Dish | Corning, USA | 430167 | 100 mm |
| TC-treated Culture Dish | Corning, USA | 430597 | 150 mm |
| Microtubes tubes | AXYGEN, USA | MCT-150-C | 1.5 mL |
| Tubes | Corning, USA | 430791 | 15 mL |
| Reagents | |||
| Ampicillin | SunShine Bio, China | 8h288h28 | |
| Anti-FLAG M2 magnetic beads | Sigma, USA | M8823 | |
| ATP | Thermo Scientific, USA | 591136 | |
| BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit | Beyotime, China | C3206 | |
| CelLyticTM M Cell Lysis Reagent | Sigma, USA | 107M4071V | |
| ClonExpress II one step cloning kit | Vazyme, China | C112 | |
| Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Kit | Thermo Scientific, USA | T1269950 | |
| dNTP | Sigma-Aldrich, USA | DNTP100-1KT | |
| DMEM | Gibco, USA | 10569044 | |
| DPBS buffer | Gibco, USA | 14190-136 | |
| EDTA | Invitrogen, USA | AM9260G | 0.5 M |
| EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche, USA | 04693132001 | |
| EndoFree Maxi Plasmid Kit | Vazyme, China | DC202 |
|
| FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit | Vazyme, China | DC301-01 | |
| FBS | Gibco, USA | 10437028 | |
| FLAG peptide | Sigma, USA | F4799 | |
| Glycerol | Sigma, USA | SHBK3676 | |
| GST Bulk Kit | GE Healthcare, USA | 27-4570-01 | |
| HEPES buffer | Sigma, USA | SLBZ2837 | 1 M |
| IPTG | Thermo Scientific, USA | 34060 | |
| KoAc | Sangon Biotech, China | 127-08-02 | |
| Lipofectamin 3000 Transfection Reagent | Thermo Scientific, USA | L3000001 | |
| MgCl2 | Invitrogen, USA | AM9530G | 1 M |
| NaCl | Invitrogen, USA | AM9759 |
5 M |
| NP-40 | Amresco, USA | M158-500ML | |
| Opti-MEM medium | Gibco, USA | 31985062 | |
| PBS | Gibco, USA | 10010023 | PH 7.4 |
| RNase Inhibitor | Promega, USA | N251B | |
| Streptavidin alkaline phosphatase | Promega, USA | V5591 | |
| TBE | Invitrogen, USA | 15581044 | |
| Tris-HCI Buffer | Invitrogen, USA | 15567027 | 1 M, PH 7.4 |
| Tris-HCI Buffer | Invitrogen, USA | 15568025 | 1 M, PH 8.0 |
| Tween-20 | Sangon Biotech, China | A600560 |
References
- Bai, S., et al. Sox30 initiates transcription of haploid genes during late meiosis and spermiogenesis in mouse testes. Development. 145 (13), (2018).
- Watanabe, T., Lin, H. Posttranscriptional regulation of gene expression by Piwi proteins and piRNAs. Molecular Cell. 56 (1), 18-27 (2014).
- Alonso, N., Guillen, R., Chambers, J. W., Leng, F. A rapid and sensitive high-throughput screening method to identify compounds targeting protein-nucleic acids interactions. Nucleic Acids Research. 43 (8), 52 (2015).
- Hwang, H., Myong, S. Protein induced fluorescence enhancement (PIFE) for probing protein-nucleic acid interactions. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1221-1229 (2014).
- Gustafsdottir, S. M., et al. In vitro analysis of DNA-protein interactions by proximity ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (9), 3067-3072 (2007).
- Li, Y., Jiang, Z., Chen, H., Ma, W. J. A modified quantitative EMSA and its application in the study of RNA–protein interactions. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 60 (2), 85-96 (2004).
- Fahrer, J., Kranaster, R., Altmeyer, M., Marx, A., Burkle, A. Quantitative analysis of the binding affinity of poly(ADP-ribose) to specific binding proteins as a function of chain length. Nucleic Acids Research. 35 (21), 143 (2007).
- Hsieh, Y. W., Alqadah, A., Chuang, C. F. An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
- Yan, G., et al. Orphan Nuclear Receptor Nur77 Inhibits Cardiac Hypertrophic Response to Beta-Adrenergic Stimulation. Molecular and Cellular Biology. 35 (19), 3312-3323 (2015).
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature Protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).
- Fillebeen, C., Wilkinson, N., Pantopoulos, K. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for the study of RNA-protein interactions: the IRE/IRP example. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
- Nishida, K. M., et al. Hierarchical roles of mitochondrial Papi and Zucchini in Bombyx germline piRNA biogenesis. Nature. 555 (7695), 260-264 (2018).
- Anders, C., Jinek, M. In vitro enzymology of Cas9. Methods in Enzymology. 546, 1-20 (2014).
- Zhao, H., Zheng, J., Li, Q. Q. A novel plant in vitro assay system for pre-mRNA cleavage during 3′-end formation. Plant Physiology. 157 (3), 1546-1554 (2011).
- Vourekas, A., et al. The RNA helicase MOV10L1 binds piRNA precursors to initiate piRNA processing. Genes & Development. 29 (6), 617-629 (2015).
- Gregersen, L. H., et al. MOV10 Is a 5′ to 3′ RNA helicase contributing to UPF1 mRNA target degradation by translocation along 3′ UTRs. Molecular Cell. 54 (4), (2014).
- Talwar, T., et al. The DEAD-box protein DDX43 (HAGE) is a dual RNA-DNA helicase and has a K-homology domain required for full nucleic acid unwinding activity. The Journal of Biological Chemistry. 292 (25), 10429-10443 (2017).
- Nagy, N. M., Konya, J. Study of fast and slow consecutive processes by heterogeneous isotope exchange using P-32 radiotracer. Journal of Radioanalytical And Nuclear Chemistry. 318 (3), 2349-2353 (2018).
- Wilson, D. L., Beharry, A. A., Srivastava, A., O’Connor, T. R., Kool, E. T. Fluorescence Probes for ALKBH2 Allow the Measurement of DNA Alkylation Repair and Drug Resistance Responses. Angewandte Chemie. 57 (39), 12896-12900 (2018).
- Wilchek, M., Bayer, E. A., Livnah, O. Essentials of biorecognition: the (strept)avidin-biotin system as a model for protein-protein and protein-ligand interaction. Immunology Letters. 103 (1), 27-32 (2006).
- Trippier, P. C. Synthetic strategies for the biotinylation of bioactive small molecules. ChemMedChem. 8 (2), 190-203 (2013).
- Rodgers, J. T., Patel, P., Hennes, J. L., Bolognia, S. L., Mascotti, D. P. Use of biotin-labeled nucleic acids for protein purification and agarose-based chemiluminescent electromobility shift assays. Analytical Biochemistry. 277 (2), 254-259 (2000).
- Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. Affinity Pulldown of Biotinylated RNA for Detection of Protein-RNA Complexes. Bio-Protocol. 6 (24), (2016).
- Bednarek, S., et al. mRNAs biotinylated within the 5′ cap and protected against decapping: new tools to capture RNA – protein complexes. Philosophical Transactions Of the Royal Society B-Biological Sciences. 373 (1762), (2018).
- Souquet, B., et al. MEIOB Targets Single-Strand DNA and Is Necessary for Meiotic Recombination. Plos Genetics. 9 (9), (2013).
- Luo, M., et al. MEIOB exhibits single-stranded DNA-binding and exonuclease activities and is essential for meiotic recombination. Nature Communications. 4, 2788 (2013).
- Xu, Y., Greenberg, R. A., Schonbrunn, E., Wang, P. J. Meiosis-specific proteins MEIOB and SPATA22 cooperatively associate with the single-stranded DNA-binding replication protein A complex and DNA double-strand breaks. Biology of Reproduction. 96 (5), 1096-1104 (2017).
