В Vesiculo Синтез прекурсоров пептидной Мембраны для автономного роста Весикл
Summary
Здесь представлены протоколы для создания пептидных основе малых unilamellar пузырьков способны к росту. Для облегчения производства везикуло мембранного пептида эти пузырьки оснащены системой транскрипции-перевода и пептидно-кодирующей плазмидой.
Abstract
Соизвобихация биохимических реакций является центральным аспектом синтетических клеток. Для этого реакционные отсеки на основе пептида служат привлекательной альтернативой липосом или пузырькам на основе жирных кислот. Внешне или в пределах пузырьков пептиды могут быть легко выражены и упростить синтез мембранных прекурсоров. Здесь предусмотрен протокол для создания пузырьков диаметром 200 нм на основе амфифильных эластиноподобных полипептидов (ELP), используя обезвоживание-регидратацию из стеклянных бусин. Также представлены протоколы для бактериального выражения И очищения ELP через обратную температуру цикла, а также их ковалентной функционализации с флуоресцентными красителями. Кроме того, в настоящем докладе описывается протокол, позволяющий транскрипции РНК aptamer dBroccoli внутри пузырьков ELP, как менее сложный пример для биохимической реакции. Наконец, предусмотрен протокол, который позволяет в везикуло экспрессии флуоресцентных белков и мембранного пептида, в то время как синтез последнего приводит к росту везикулы.
Introduction
К созданию синтетических живых клеточных систем обычно подходят с двух разных направлений. В методе «сверху вниз» геном бактерии сводится к ее основным компонентам, что в конечном итоге приводит к минимальной клетке. При подходе «снизу вверх» искусственные клетки собираются из молекулярных компонентов или клеточных подсистем, которые должны быть функционально интегрированы в последовательную клеточную систему.
При подходе de novo разобщенное необходимые биохимические компоненты обычно достигается с помощью мембран, изготовленных из фосфолипидов или жирных кислот1,2,3,4. Это потому, что “современные” клеточные мембраны в основном состоят из фосфолипидов, в то время как жирные кислоты считаются правдоподобными кандидатами пребиотических мембранных корпусов5,6. Для образования новых мембран или для облегчения роста мембраны, амфифилические строительные блоки должны быть предоставлены из внешнего7 или в идеале через производство в мембранном отсеке с использованием соответствующих анаболических процессов4 ,8.
В то время как синтез липидов является относительно сложным метаболическим процессом, пептиды могут быть произведены довольно легко с помощью клеточных реакций экспрессии генов9,10. Таким образом, пептидные мембраны, образованные амфифильных пептидов представляют собой интересную альтернативу липидных мембран в качестве корпусов для искусственных клеток мимики, которые способны расти11.
Амфифильные эластиновые диблокитеры (ELPs) являются привлекательным классом пептидов, которые могут служить строительным блоком для таких мембран12. Основной мотив аминокислотной последовательности ELPs является (GaGVP)n, где “а” может быть любой аминокислоты, за исключением пролин и “n” является число мотив повторяет13,14,15,16,17 . ELPs были созданы с гидрофобным блоком, содержащим главным образом фенилаланин для и гидрофильных блоков в основном состоит из глутаминовой кислоты11. В зависимости от параметров раствора, таких как рН и концентрация соли, ELPsдемонстрируют так называемый обратный переход температуры при температуре T t, где пептиды проходят полностью обратимый переход фазы от гидрофильной к гидрофобной Государства. Синтез пептидов может быть легко реализован внутри пузырьков с помощью экстракта бактериальных клеток “TX-TL”11,18,19,20,21, который обеспечивает все необходимые компоненты для сочетания транскрипции и переводческих реакций.
TX-TL система была инкапсулирована вместе, с шаблоном ДНК кодирования ELPs в ELP пузырьков с использованием обезвоживания-регидратации из стеклянных бусин в качестве твердой поддержки. Формирование пузырьков происходит путем регидратации высушенных пептидов с поверхности бисера11. Другие методы22 для образования везикулы могут быть использованы, которые потенциально показывают более низкую polydispersity и более большие размеры везикулы (например, электро-образование, передача участка эмульсии, или microfluidics-основанные методы). Для проверки жизнеспособности метода инкапсуляции, транскрипция флюорогенного aptamer dBroccoli23 может быть использована в качестве альтернативы11, что является менее сложным, чем экспрессия генов с системой TX-TL.
Благодаря экспрессии мембранных строительных блоков в везикуло и их последующему включению в мембрану, пузырьки начинают расти11. Мембрана включения ELPs может быть продемонстрирована с помощью исследования FRET. С этой целью, ELPs, используемые для формирования первоначальной популяции везикл, спрягаются с флуоресцентными красителями в равных долях, составляющих пару FRET. При экспрессии немаркированных ELPs в vesiculo и их вхождение в мембрану, помеченные ЭЛП в мембране разбавляются и, следовательно, сигнал FRET уменьшается11. В качестве универсального и распространенного метода спряжения используется медь катализированный азиде-алкын циклоуг. При использовании стабилизирующего лиганда, такого как трис (бензилтриазолметилметил)-амин, реакция может осуществляться в вавном растворе при физиологическом рН без гидролиза реагентов11, что подходит для спряжений реакций с пептидами.
В следующем протоколе представлено подробное описание подготовки к выращиванию пептидосом на основе ELP. Описано выражение пептидов и образование везикул с использованием метода стеклянных бусин. Кроме того, описано, как реализовать транскрипцию флюорогенного апртами dBroccoli aptamer и транскрипции-перевод реакции для экспрессии белка внутри пузырьков ELP. Наконец, при условии, что это процедура для спряжения ЭЛП с флюорофорами, которые могут быть использованы для доказательства роста везикля через FRET ассссе11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Регидратация пленки является общей процедурой для создания небольших униламеллярных пузырьков. Основным источником отказа является неправильное обращение с материалами, используемыми в процедуре.
Первоначально ЭЛП производятся к?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы с благодарностью отмечаем финансовую поддержку через DFG TRR 235 (Появление жизни, проект P15), Европейский исследовательский совет (грантовое соглашение No 694410 AEDNA) и Международную высшую школу науки и инженерии TUM (проект No 9.05) . Мы благодарим Э. Фальгенгауэр за помощь в подготовке образцов. Мы благодарим А. Дупина и М. Шварца-Шиллинга за помощь в системе TX-TL и полезные дискуссии. Мы благодарим Н.Б. Холланда за полезные дискуссии.
Materials
| 2xYT | MP biomedicals | 3012-032 | |
| 3-PGA | Sigma-Aldrich | P8877 | |
| 5PRIME Phase Lock GelTM tube | VWR | 733-2478 | |
| alkine-conjugated Cy3 | Sigma-Aldrich | 777331 | |
| alkine-conjugated Cy5 | Sigma-Aldrich | 777358 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| benzamidin | Carl Roth | CN38.2 | |
| BL21 Rosetta 2 E. coli strain | Novagen | 71402 | |
| Bradford BSA Protein Assay Kit | Bio-rad | 500-0201 | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | A9501 | |
| carbenicillin | Carl Roth | 6344.2 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| chloramphenicol | Carl Roth | 3886.3 | |
| chloroform | Carl Roth | 4432.1 | |
| CoA | Sigma-Aldrich | C4282 | |
| CTP | USB | 14121 | |
| CuSO4 | Carl Roth | P024.1 | |
| DFHBI | Lucerna Technologies | 410 | |
| DMSO | Carl Roth | A994.1 | |
| DNase I | NEB | M0303S | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Ethanol | Carl Roth | 9065.2 | |
| Folinic acid | Sigma-Aldrich | F7878 | |
| Glass beads, acid-washed | Sigma-Aldrich | G1277 | |
| GTP | USB | 16800 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H6147 | |
| IPTG (β-isopropyl thiogalactoside ) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| KCl | Carl Roth | P017.1 | |
| K-glutamate | Sigma-Aldrich | G1149 | |
| LB Broth | Carl Roth | X968.2 | |
| lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| methanol | Carl Roth | 82.2 | |
| MgCl2 | Carl Roth | KK36.3 | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | |
| Micro Bio-Spin Chromatography Columns | Bio-Rad | 732-6204 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N6522 | |
| NHS-azide linker (y-azidobutyric acid oxysuccinimide ester) | Baseclick | BCL-033-5 | |
| PEG-8000 | Carl Roth | 263.2 | |
| pH stripes | Carl Roth | 549.2 | |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Carl Roth | 6367.2 | |
| phosphate-buffered saline | VWR | 76180-684 | |
| phosphoric acid | Sigma-Aldrich | W290017 | |
| polyethyleneimine | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Potassium phosphate dibasic solution | Sigma-Aldrich | P8584 | |
| Potassium phosphate monobasic solution | Sigma-Aldrich | P8709 | |
| Qiagen Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| RNAPol reaction buffer | NEB | B9012 | |
| RNase inhibitor murine | NEB | M0314S | |
| RNaseZap Wipes | ThermoFisher | AM9788 | |
| rNTP | NEB | N0466S | |
| Roti-Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol | Carlroth | A156.1 | |
| RTS Amino Acid Sampler | 5 Prime | 2401530 | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit) | Thermo-Scientific | 66382 | |
| sodium chloride | Carl Roth | 9265.1 | |
| sodium hydroxide | Carl Roth | 8655.1 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558 | |
| sterile-filtered (0.22 µm filter) | Carl Roth | XH76.1 | |
| T7 polymerase | NEB | M0251S | |
| TBTA (tris(benzyltriazolylmethyl)amine) | Sigma-Aldrich | 678937 | |
| TCEP (tris(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride) | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Tris base | Fischer | BP1521 | |
| tRNA (from E. coli) | Roche Applied Science | MRE600 | |
| UTP | USB | 23160 |
References
- Chen, I. A., Szostak, J. W. A kinetic study of the growth of fatty acid vesicles. Biophysical Journal. 87 (2), 988-998 (2004).
- Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane. Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3114-3118 (2012).
- Hardy, M. D., et al. Self-reproducing catalyst drives repeated phospholipid synthesis and membrane growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8187-8192 (2015).
- Scott, A., et al. Cell-Free Phospholipid Biosynthesis by Gene-Encoded Enzymes Reconstituted in Liposomes. PLoS ONE. 11 (10), e0163058 (2016).
- Deamer, D. W., Barchfeld, G. L. Encapsulation of macromolecules by lipid vesicles under simulated prebiotic conditions. Journal of Molecular Evolution. 18 (3), 203-206 (1982).
- Adamala, K., Szostak, J. W. Nonenzymatic Template-Directed RNA Synthesis Inside Model Protocells. Science. 342 (6162), 1098-1100 (2013).
- Zhu, T. F., Szostak, J. W. Coupled growth and division of model protocell membranes. Journal of the American Chemical Society. 131 (15), 5705-5713 (2009).
- Kurihara, K., et al. Self-reproduction of supramolecular giant vesicles combined with the amplification of encapsulated DNA. Nature Chemistry. 3 (10), 775-781 (2011).
- Chu, H. -. S., et al. Expression analysis of an elastin-like polypeptide (ELP) in a cell-free protein synthesis system. Enzyme and Microbial Technology. 46 (2), 87-91 (2010).
- Martino, C., et al. Protein Expression, Aggregation, and Triggered Release from Polymersomes as Artificial Cell-like Structures. Angewandte Chemie International Edition. 51 (26), 6416-6420 (2012).
- Vogele, K., et al. Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments. Nature Communications. 9 (1), 3862 (2018).
- Huber, M. C., et al. Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments. Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).
- McPherson, D. T., Xu, J., Urry, D. W. Product purification by reversible phase transition following Escherichia coli expression of genes encoding up to 251 repeats of the elastomeric pentapeptide GVGVP. Protein Expression and Purification. 7 (1), 51-57 (1996).
- Urry, D. W. Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers. The Journal of Physical Chemistry B. 101 (51), 11007-11028 (1997).
- Urry, D. W., et al. Elastin: a representative ideal protein elastomer. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).
- Meyer, D. E., Chilkoti, A. Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides. Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).
- Meyer, D. E., Chilkoti, A. Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system. Biomacromolecules. 3 (2), 357-367 (2002).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
- Caschera, F., Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie. 99, 162-168 (2014).
- Schwarz-Schilling, M., Aufinger, L., Mückl, A., Simmel, F. C. Chemical communication between bacteria and cell-free gene expression systems within linear chains of emulsion droplets. Integrative Biology. 8 (4), 564-570 (2016).
- Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synthetic Biology. 5 (4), 344-355 (2016).
- Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking. Chemical Society Reviews. 47 (23), 8572-8610 (2018).
- Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Broccoli Jaffrey, S. R. Broccoli: Rapid Selection of an RNA Mimic of Green Fluorescent Protein by Fluorescence-Based Selection and Directed Evolution. Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).
- Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences. Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).
