En Vesiculo Síntesis de Precursores de Membrana De péptido para crecimiento de la vesícula Autónoma
Summary
Aquí se presentan protocolos para la creación de pequeñas vesículas unilamelares basadas en péptidos capaces de crecer. Para facilitar la producción vesiculo del péptido de membrana, estas vesículas están equipadas con un sistema de transcripción-traducción y el plásmido codificante de péptidos.
Abstract
La compartimentación de las reacciones bioquímicas es un aspecto central de las células sintéticas. Para este propósito, los compartimentos de reacción basados en péptidos sirven como una alternativa atractiva a los liposomas o vesículas a base de ácidos grasos. Externamente o dentro de las vesículas, los péptidos se pueden expresar fácilmente y simplificar la síntesis de precursores de membrana. Aquí se proporciona un protocolo para la creación de vesículas con diámetros de 200 nm basados en los polipéptidos anfifílicos similares a la elastina (ELP) utilizando la deshidratación-rehidratación de cuentas de vidrio. También se presentan los protocolos para la expresión y purificación de ELP bacteriana a través del ciclo de temperatura inversa, así como su funcionalización covalente con colorantes fluorescentes. Además, este informe describe un protocolo para permitir la transcripción del ARN aptamer dBroccoli dentro de las vesículas ELP como un ejemplo menos complejo para una reacción bioquímica. Por último, se proporciona un protocolo, que permite la expresión vesiculo de proteínas fluorescentes y el péptido de membrana, mientras que la síntesis de este último da lugar al crecimiento de la vesícula.
Introduction
La creación de sistemas celulares sintéticos vivos se aborda generalmente desde dos direcciones diferentes. En el método de arriba hacia abajo, el genoma de una bacteria se reduce a sus componentes esenciales, lo que en última instancia conduce a una célula mínima. En el enfoque ascendente, las células artificiales se ensamblan de novo a partir de componentes moleculares o subsistemas celulares, que necesitan integrarse funcionalmente en un sistema similar a una célula consistente.
En el enfoque de novo, la compartimentación de los componentes bioquímicos necesarios se logra generalmente utilizando membranas hechas de fosfolípidos o ácidos grasos1,2,3,4. Esto se debe a que las membranas celulares “modernas” consisten principalmente en fosfolípidos, mientras que los ácidos grasos se consideran candidatos plausibles de recintos de membrana prebióticos5,6. Para la formación de nuevas membranas o para facilitar el crecimiento de la membrana, los bloques de construcción anfifílicos deben proporcionarse desde el exterior7 o idealmente a través de la producción dentro de un compartimento membranoso utilizando los procesos anabólicos correspondientes4 ,8.
Mientras que la síntesis de lípidos es un proceso metabólico relativamente complejo, los péptidos se pueden producir con bastante facilidad utilizando reacciones de expresión génica libre de células9,10. Por lo tanto, las membranas peptídicas formadas por péptidos anfifílicos representan una alternativa interesante a las membranas lipídicas como recintos para imitaciones celulares artificiales que son capaces de crecer11.
Los copolímeros dibloquealinas anfifílicas similares a dibloques (ELP) son una atractiva clase de péptidos, que pueden servir como bloque de construcción para tales membranas12. El motivo básico de secuencia de aminoácidos de ELPs es (GaGVP)n, donde “a” puede ser cualquier aminoácido excepto prolina y “n” es el número de repeticiones de motivo13,14,15,16,17 . Los ELP se han creado con un bloque hidrófobo que contiene principalmente fenilalanina para un y un bloque hidrófilo compuesto principalmente de ácido glutámico11. Dependiendo de los parámetros de una y solución, como el pH y la concentración de sal, los ELP presentan una llamada transición inversa de la temperatura a temperatura Tt, donde los péptidos se someten a una transición de fase totalmente reversible de un hidrófilo a un hidrofóbico Estado. La síntesis de los péptidos se puede implementar fácilmente dentro de las vesículas utilizando el extracto de células bacterianas “TX-TL”11,18,19,20,21, que proporciona todos los componentes necesarios para la transcripción acoplada y las reacciones de traducción.
El sistema TX-TL fue encapsulado juntos, con la plantilla de ADN que codifica los ELP en vesículas ELP utilizando la deshidratación-rehidratación de cuentas de vidrio como un soporte sólido. La formación de vesículas se produce a través de la rehidratación de los péptidos secos de la superficie del cordón11. Se pueden utilizar otros métodos22 para la formación de vesículas, que potencialmente muestran una polidispersidad más baja y tamaños de vesícula más grandes (por ejemplo, electroformación, transferencia de fase de emulsión o métodos basados en microfluídicos). Para probar la viabilidad del método de encapsulación, la transcripción del aptámero fluorogénico dBroccoli23 se puede utilizar alternativamente11,que es menos compleja que la expresión génica con el sistema TX-TL.
Debido a la expresión de los bloques de construcción de membrana en vesiculo y su posterior incorporación a la membrana, las vesículas comienzan a crecer11. La incorporación de membrana de los ELP se puede demostrar a través de un ensayo FRET. Con este fin, los ELP utilizados para la formación de la población inicial de vesículas se conjugan con colorantes fluorescentes en partes iguales que constituyen un par FRET. Tras la expresión de ELP no etiquetados en vesiculo y su incorporación a la membrana, los ELP etiquetados en la membrana se diluyen y, en consecuencia, la señal FRET disminuye11. Como método versátil y común para la conjugación, se utiliza la cicloadición de azide-alquino catalizada en cobre. Con el uso de un ligando estabilizador como tris(benzyltriazolylmethyl)-amine, la reacción se puede llevar a cabo en una solución acuosa a un pH fisiológico sin la hidrólisis de los reactivos11,que es apropiado para reacciones de conjugación péptidos.
El siguiente protocolo presenta una descripción detallada de la preparación para el cultivo de peptidosomas basados en ELP. Se describe la expresión de los péptidos y la formación de vesículas utilizando el método de cuentas de vidrio. Además, se describe cómo implementar la transcripción del aptámero fluorogénico de dBroccoli y la reacción de transcripción-traducción para la expresión de proteínas dentro de las vesículas ELP. Por último, se proporciona un procedimiento para la conjugación de ELP con fluoróforos, que se puede utilizar para probar el crecimiento de la vesícula a través de un ensayo FRET11.
Protocol
Representative Results
Discussion
La rehidratación cinematográfica es un procedimiento común para la creación de pequeñas vesículas unilamellares. La principal fuente de fallo es el manejo incorrecto de los materiales utilizados en el procedimiento.
Inicialmente, los ELP son producidos por células de E. coli. El rendimiento después de la purificación de ELP puede variar significativamente dependiendo de la cuidadosa realización del protocolo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos el apoyo financiero a través de la DFG TRR 235 (Emergence of Life, proyecto P15), el Consejo Europeo de Investigación (acuerdo de subvención no 694410 AEDNA) y la TUM International Graduate School for Science and Engineering IGSSE (proyecto no 9.05) . Agradecemos a E. Falgenhauer por su ayuda con la preparación de muestras. Agradecemos a A. Dupin y M. Schwarz-Schilling por su ayuda con el sistema TX-TL y discusiones útiles. Agradecemos a N. B. Holland por sus útiles discusiones.
Materials
| 2xYT | MP biomedicals | 3012-032 | |
| 3-PGA | Sigma-Aldrich | P8877 | |
| 5PRIME Phase Lock GelTM tube | VWR | 733-2478 | |
| alkine-conjugated Cy3 | Sigma-Aldrich | 777331 | |
| alkine-conjugated Cy5 | Sigma-Aldrich | 777358 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| benzamidin | Carl Roth | CN38.2 | |
| BL21 Rosetta 2 E. coli strain | Novagen | 71402 | |
| Bradford BSA Protein Assay Kit | Bio-rad | 500-0201 | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | A9501 | |
| carbenicillin | Carl Roth | 6344.2 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| chloramphenicol | Carl Roth | 3886.3 | |
| chloroform | Carl Roth | 4432.1 | |
| CoA | Sigma-Aldrich | C4282 | |
| CTP | USB | 14121 | |
| CuSO4 | Carl Roth | P024.1 | |
| DFHBI | Lucerna Technologies | 410 | |
| DMSO | Carl Roth | A994.1 | |
| DNase I | NEB | M0303S | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Ethanol | Carl Roth | 9065.2 | |
| Folinic acid | Sigma-Aldrich | F7878 | |
| Glass beads, acid-washed | Sigma-Aldrich | G1277 | |
| GTP | USB | 16800 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H6147 | |
| IPTG (β-isopropyl thiogalactoside ) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| KCl | Carl Roth | P017.1 | |
| K-glutamate | Sigma-Aldrich | G1149 | |
| LB Broth | Carl Roth | X968.2 | |
| lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| methanol | Carl Roth | 82.2 | |
| MgCl2 | Carl Roth | KK36.3 | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | |
| Micro Bio-Spin Chromatography Columns | Bio-Rad | 732-6204 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N6522 | |
| NHS-azide linker (y-azidobutyric acid oxysuccinimide ester) | Baseclick | BCL-033-5 | |
| PEG-8000 | Carl Roth | 263.2 | |
| pH stripes | Carl Roth | 549.2 | |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Carl Roth | 6367.2 | |
| phosphate-buffered saline | VWR | 76180-684 | |
| phosphoric acid | Sigma-Aldrich | W290017 | |
| polyethyleneimine | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Potassium phosphate dibasic solution | Sigma-Aldrich | P8584 | |
| Potassium phosphate monobasic solution | Sigma-Aldrich | P8709 | |
| Qiagen Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| RNAPol reaction buffer | NEB | B9012 | |
| RNase inhibitor murine | NEB | M0314S | |
| RNaseZap Wipes | ThermoFisher | AM9788 | |
| rNTP | NEB | N0466S | |
| Roti-Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol | Carlroth | A156.1 | |
| RTS Amino Acid Sampler | 5 Prime | 2401530 | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit) | Thermo-Scientific | 66382 | |
| sodium chloride | Carl Roth | 9265.1 | |
| sodium hydroxide | Carl Roth | 8655.1 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558 | |
| sterile-filtered (0.22 µm filter) | Carl Roth | XH76.1 | |
| T7 polymerase | NEB | M0251S | |
| TBTA (tris(benzyltriazolylmethyl)amine) | Sigma-Aldrich | 678937 | |
| TCEP (tris(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride) | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Tris base | Fischer | BP1521 | |
| tRNA (from E. coli) | Roche Applied Science | MRE600 | |
| UTP | USB | 23160 |
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