Différenciation pan-myéloïde du sang de cordon humain Dérivé CD34- Cellules hématopoïétiques de tige et progénitrice
Summary
Ici, nous présentons un protocole pour la caractérisation immunophenotypic et la différenciation induite par cytokine du sang de cordon dérivé CD34– cellules hématopoïétiques de tige et progénitrice aux quatre lignées myéloïdes. Les applications de ce protocole comprennent des études sur l’effet des mutations de la maladie myéloïde ou de petites molécules sur la différenciation myéloïde descellules CD34.
Abstract
La différenciation ex vivo des cellules souches hématopoïétiques humaines est un modèle largement utilisé pour étudier l’hématopoiesis. Le protocole décrit ici est pour la différenciation induite par cytokine des cellules de tige et d’progéniture de CD34– hématopoïétique aux quatre cellules myéloïdes de lignée. Lescellules CD34 sont isolées du sang de cordon ombilical humain et co-cultivées avec des cellules stromales MS-5 en présence de cytokines. La caractérisation immunophénotypique des cellules souches et progénitrices, et des cellules de lignée myéloïdes différenciées sont décrites. À l’aide de ce protocole, lescellules CD34 peuvent être incubées avec de petites molécules ou transduisantes avec des lentivirus pour exprimer des mutations de la myéloïde pour étudier leur impact sur la différenciation myéloïde.
Introduction
La différenciation normale des cellules souches hématopoïétiques (HSC) est essentielle pour le maintien des niveaux physiologiques de toutes les lignées de cellules sanguines. Au cours de la différenciation, dans une réponse coordonnée aux indices extracellulaires, y compris les facteurs de croissance et les cytokines, les HSC donnent d’abord lieu à des cellules progénitrices multipotentes (MPP) qui ont un potentiel lympho-myéloïde1,2,3 ,4 (Figure 1). Les MPP donnent lieu à des progéniteurs myéloïdes communs (PMC) et à des progéniteurs lymphoïdes communs (CLP) qui sont limités par la lignée. Les CLP se différencient en lignées lymphoïdes composées de cellules tueuses B, T et naturelles. Les CmP génèrent les lignées myéloïdes à travers deux populations d’ancêtres plus restreintes, les progéniteurs d’érythroïdes mégacaryocytes (MEPs) et les progéniteurs de monocytes granulocytes (GMP). Les députés donnent lieu à des mégacaryocytes et des érythrocytes, tandis que les GMP donnent lieu à des granulocytes et des monocytes. En plus de surgir par le biais des PMC, les mégacaryocytes ont été signalés pour provenir directement de HSCs ou premiers MPP par des voies non-canoniques5,6.
Les cellules hématopoïétiques de tige et d’ancêtre (HSPc) sont caractérisées par le marqueur de surface CD34 et l’absence de marqueurs spécifiques de lignée (Lin–). D’autres marqueurs de surface couramment utilisés pour distinguer les HSC et les populations d’ancêtres myéloïdes comprennent CD38, CD45RA et CD1232 (figure 1). Les HSC et les MPP sont Lin–/CD34–/CD38– et Lin–/CD34etCD38 , respectivement. Les populations d’ancêtres myéloïdes se distinguent par la présence ou l’absence de CD45RA et de CD123. Les CMP sont Lin–/CD34–/CD38/CD45RA–/CD123lo, les GmP sont Lin–/CD34–/CD38–/CD45RA–/CD123lo, et les députés sont Lin–/CD34 /CD38/CD45RA–/CD123–.
La population totale de cellules souches et progénitrices CD34 peut être obtenue à partir du sang de cordon ombilical humain (UCB), de la moelle osseuse et du sang périphérique. CD34– les cellules constituent 0,02% à 1,46% du total des cellules mononucléaires (MNC) dans l’UCB humain, tandis que leur pourcentage varie entre 0,5% et 5,3% dans la moelle osseuse et est beaucoup plus faible à 0,01% dans le sang périphérique7,8,9 . La capacité de prolifération et le potentiel de différenciation descellules CD34 dérivées de l’UCB sont significativement plus élevés que ceux de la moelle osseuse ou des cellules sanguines périphériques1,10, offrant ainsi un avantage distinct pour l’obtention matériel suffisant pour des analyses moléculaires en combination avec la caractérisation immunophenotypic et morphologique exécutante des cellules pendant la différenciation.
La différenciation ex vivo du sang de cordon ombilical dérivé CD34– HSPCs est un modèle largement appliqué pour étudier l’hématopoiesis normal et les mécanismes de la maladie hématopoïétique. Lorsqu’ils sont cultivés avec les cytokines appropriées, les UCB CD34et HSPC peuvent être induits à se différencier le long des lignées myéloïdes ou lymphoïdes11,12,13,14,15 , 16. Ici, nous décrivons des protocoles pour l’isolement et la caractérisation immunophénotypique des CD34– HSPc de l’UCB humain, et pour leur différenciation aux cellules de lignée myéloïdes. Ce système de culture est basé sur la différenciation induite par la cytokine des HSPC en présence de cellules stromales MS-5 pour imiter le microenvironnement dans la moelle osseuse. Les conditions de culture provoquent une expansion initiale descellules CD34, suivies de leur différenciation aux cellules qui expriment des marqueurs pour les quatre cellules de lignée myéloïde, à savoir les granulocytes (CD66b), les monocytes (CD14), les mégacaryocytes (CD41), et érythrocytes (CD235a). Les applications du protocole de différenciationdes cellules CD34 comprennent des études sur les mécanismes moléculaires régulant l’hématopoiesis, et des études de l’impact des mutations associées à la myéloïde et des petites molécules sur l’auto-renouvellement et différenciation des HSPC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit ici convient à la différenciation ex vivo des CD34 cD34 dérivés de l’UCBet des HSPC aux quatre lignées myéloïdes. L’incubation initiale avec un mélange de cytokine composé de SCF, TPO, Flt3L et IL3 stimule lescellules CD34. Par la suite, la différenciation est réalisée avec un cocktail de SCF, IL3, Flt3L, EPO et TPO. Dans ce mélange, SCF, IL3, et Flt3L sont importants pour la survie et la prolifération des CD34– HSCs. EPO et TPO favorisent la différenci…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tient à remercier Wendy Barrett, Rachel Caballero et Gabriella Ruiz de Maricopa Integrated Health Systems pour les unités de sang de cordon désitruré et données, Mrinalini Kala pour l’aide à la cytométrie du débit, et Gay Crooks et Christopher Seet pour conseils sur la différenciation myéloïde ex vivo. Ce travail a été soutenu par des fonds à S.S. des National Institutes of Health (R21CA170786 et R01GM127464) et de l’American Cancer Society (la Subvention de recherche institutionnelle 74-001-34-IRG). Le contenu est uniquement de la responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles des National Institutes of Health.
Materials
| 0.4% Trypan blue solution | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | Dilute working stock to 0.2% in sterile 1x PBS |
| 0.5 M UltraPure Ethylene diamine tetra acetic acid, pH 8.0 | Gibco | 15575-038 | |
| 10x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14185052 | Dilute to 1x with sterile distilled water & pH to 7.2 |
| 2.5% Trypsin, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15090046 | Dilute working stock to 1x with sterile 1x PBS |
| 30 µm Pre-separation filters | Miltenyi biotech | 130-041-407 | |
| 35% sterile Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7979 | |
| 7-AAD | Biolegend | 420404 | Used as a live/dead stain to eliminate dead cells from FACS analysis |
| Anti-human CD10-FITC antibody (Clone HI10a) | Biolegend | 312207 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD11b-FITC (activated) antibody (Clone CBRM1/5) | Biolegend | 301403 | Use 1:5 dilution |
| Anti-human CD123-APC antibody (Clone 6H6) | Biolegend | 306012 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD14-PE antibody (Clone M5E2) | Biolegend | 301806 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD19-FITC antibody (Clone 4G7) | BD Biosciences | 347543 | Use 1:5 dilution |
| Anti-human CD235a-APC antibody (Clone GA-R2 (HIR2)) | BD Biosciences | 551336 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD235a-FITC antibody (Clone HIR2) | Biolegend | 306609 | Use 1:50 dilution |
| Anti-human CD34-APC-Cy7 antibody (Clone 581) | Biolegend | 343514 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD38-PE antibody (Clone HIT2) | Biolegend | 303506 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD3-FITC antibody (Clone UCHT1) | Biolegend | 300405 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD41a-PerCP-Cy5.5 antibody (Clone HIP8) | Biolegend | 303720 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD45Ra-PE-Cy7 antibody (Clone HI100) | Biolegend | 304126 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD66b-PE-Cy7 antibody (Clone G10F5) | Biolegend | 305116 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD7-FITC antibody (Clone CD7-6B7) | Biolegend | 343103 | Use 1:20 dilution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | Filter sterilize before use |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) powder with L-Glutamine | Gibco | 12100046 | Reconstitute 1 packet to make 1 L of DMEM media with sodium bicarbonate, 10% FBS & 1% penicillin & streptomycin |
| Fetal bovine serum, Australian source, heat inactivated | Omega Scientific | FB-22 Lot #609716 | |
| Human CD34 microbead kit | Miltenyi biotech | 130-046-702 | |
| Human Thrombopoietin (TPO), research grade | Miltenyi biotech | 130-094-011 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 50 ng/mL for both myeloid differentiation & stimulation medium |
| L-Glutamine | Omega Scientific | GS-60 | 2 mM concentration in stimulation medium |
| LS Columns | Miltenyi biotech | 130-042-401 | |
| MACS Multi stand | Miltenyi biotech | 130-042-303 | |
| MidiMACS magnetic separator | Miltenyi biotech | 130-042-302 | |
| MNC fractionation media (Ficol-Paque PLUS) | GE Healthcare Biosciences | 17-1440-03 | |
| MS-5 cells | Gift from the laboratory of Gay Crooks, UCLA | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Heat 800 mL of 1x PBS in a glass beaker on a stir plate in a chemical hood to ~65 °C. Add 10 g of paraformaldehyde powder. To completely dissolve the paraformaldehyde, raise the pH by adding 1 N NaOH. Cool and filter the solution and make up the volume to 1 L with 1x PBS. Adjust the pH to 7.2. |
| Penicillin & Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ml | |
| Poly-L lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | Make a 10 mg/mL stock in 1x PBS |
| Recombinant human erythropoietin-alpha (rHu EPO-α) | BioBasic | RC213-15 | Make a stock of 2000 units/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 4 units/mL for myeloid differentiation |
| Recombinant human fibronectin fragment (RetroNectin) | Takara | T100B | Use 20 µg/mL diluted in sterile 1x PBS to coat wells prior to stimulation of CD34+ HSCs. |
| Recombinant human Flt-3 ligand (rHu Flt-3L) | BioBasic | RC214-16 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium |
| Recombinant human interleukin-3 (rHu IL-3) | BioBasic | RC212-14 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 20 ng/mL in stimulation medium |
| Recombinant human stem cell factor (rHu SCF) | BioBasic | RC213-12 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium |
| Serum free medium (X-Vivo-15) | Lonza | 04-418Q | |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Wright-Giemsa stain, modified | Sigma-Aldrich | WG16-500 | Use according to manufacturer's instructions |
| Equipment | |||
| BD LSR II flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Centrifuge | Sorvall Legend RT | ||
| Light microscope | Olympus |
References
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