Metodo Ex Vivo per valutare la motilità spontanea del tratto riproduttivo del mouse e un algoritmo di tracciamento del movimento uterico basato su MATLAB per l'analisi dei dati

Summary

Le contrazioni uterine sono importanti per il benessere delle femmine. Tuttavia, la contrattilità patologicamente aumentata può provocare dismenorrea, specialmente nelle femmine più giovani. Qui, descriviamo una semplice preparazione ex vivo che consente una rapida valutazione dell’efficacia dei rilassanti muscolari lisci che possono essere utilizzati per il trattamento della dismenorrea.

Abstract

La dismenorrea, o crampi dolorosi, è il sintomo più comune associato alle mestruazioni nelle femmine e la sua gravità può ostacolare la vita quotidiana delle donne. Qui, presentiamo un metodo facile ed economico che sarebbe strumentale per testare nuovi farmaci che riducono la contrattilità uterina. Questo metodo utilizza la capacità unica dell’intero tratto riproduttivo del mouse di mostrare motilità spontanea se mantenuto ex vivo in una parabola Petri contenente buffer Krebs ossigenato. Questa motilità spontanea assomiglia all’attività miometria simile all’onda dell’utero umano, indicato come onde endometriali. Per dimostrare l’efficacia del metodo, abbiamo impiegato un noto farmaco rilassante uterino, epinefrina. Dimostriamo che la motilità spontanea dell’intero tratto riproduttivo del topo può essere inibita rapidamente e reversibilmente da 1 epinefrina in questo modello di piatto Petri. Documentare i cambiamenti di motilità uterina può essere facilmente fatto utilizzando un normale smartphone o una sofisticata fotocamera digitale. Abbiamo sviluppato un algoritmo basato su MATLAB che consente al tracciamento del movimento di quantificare i cambiamenti spontanei di motilità uterina misurando la velocità dei movimenti del corno uterino. Uno dei principali vantaggi di questo approccio ex vivo è che il tratto riproduttivo rimane intatto per tutto l’esperimento, preservando tutte le interazioni cellulari intrinseche intrauterine. La limitazione principale di questo approccio è che fino al 10-20% degli uteri non può presentare motilità spontanea. Finora, questo è il primo metodo quantitativo ex vivo per valutare la motilità uterina spontanea in un modello di piatto Petri.

Introduction

Come un importante organo femminile, l’utero è cruciale per la riproduzione ed essenziale per il nutrimento del feto¹. L’utero è costituito da tre strati: il perimetrio, miometrio ed endometrio. Il miometrio è il principale strato contrattuale dell’utero e svolge un ruolo chiave nella consegna del feto. L’endometrio è lo strato più interno che riveste la cavità uterina ed è essenziale per l’impianto dell’embrione. Nelle femmine non incinte in età riproduttiva, lo strato endometriale viene versato mensilmente all’inizio del ciclo mestruale. Il miometrio aiuta in questo processo di spargimento mantenendo le contrazioni miometriche spontanee necessarie per eliminare il tessuto endometriale necrotico dall’utero¹.

Purtroppo, aumento della contrattilità miometriale può provocare effetti collaterali negativi come dismenorrea, o crampi mestruali dolorosi. Questo è particolarmente visto nelle giovani femmine e nelle donne nullime². Tuttavia, la dismenorrea è diversa per ogni donna e dipende dalla forza delle loro contrazioni miometriche; contrazioni più forti sono spesso associate alla sensazione di gravi crampi³. La contrattilità miometriale può essere visualizzata utilizzando ultrasuoni uterini ed è spesso riconosciuta come onde endometriali. Maggiore rilascio di prostaglandine durante le mestruazioni⁴ in un utero sottoposto a sloughing endometriale è creduto per contribuire ad aumento dell’ipercontrattualità miometria, conseguente ischemia e ipossia del muscolo uterino e quindi aumentato dolore³.

Grave dismenorrea può ostacolare l’attività quotidiana di alcune donne e 3 a 33% delle donne hanno dolore molto grave, che potrebbe causare una donna a letto per 1 a 3 giorni ogni ciclo mestruale⁵. La dismenorrea è la principale causa di morbilità ginecologica nelle donne in età riproduttiva indipendentemente dall’età, dalla nazionalità e dallo status economico⁵. La prevalenza stimata di dismenorrea è alta e variabile, che va dal 45% al 93% nelle donne di età riproduttiva⁵.  Il dolore associato alla dismenorrea ha un effetto sulla vita quotidiana delle donne e può provocare scarse prestazioni accademiche negli adolescenti, minore qualità del sonno, restrizione delle attività quotidiane e cambiamenti di umore⁵.

Molte donne che sperimentano grave dismenorrea ricorrono a farmaci da banco per alleviare il loro dolore. Tali farmaci da banco contengono inibitori cicloossigenasi (COX) che impediscono la formazione di prostaglandine^{6 .} Tuttavia, gli inibitori di COX sono associati a eventi cardiovascolari avversi e circa il 18% delle donne con dismenorrea non risponde a questi inibitori⁷. Pertanto, vi è la necessità di nuovi farmaci per ridurre i crampi mestruali. Poiché oltre la contrattilità dell’utero contribuisce alla patogenesi della dismenorrea, una possibile strategia può essere l’uso di rilassanti uterini.

È utile quantificare gli effetti di potenziali farmaci rilassanti in un modello di contrazioni miometriche miometriche naturali. Tuttavia, finora, non è stato descritto alcun metodo ex vivo efficiente per testare farmaci che rilassano i muscoli nell’utero intatto. Attualmente, le misurazioni della tensione isometrica vengono utilizzate per valutare gli effetti del farmaco rilassante. Durante tali misurazioni, una striscia muscolare uterina viene mantenuta ad una lunghezza costante sotto precarico in un bagno di tessuto mentre la forza delle contrazioni muscolari uterine viene registrata prima e dopo la stimolazione dell’ossitocina in presenza o assenza di un farmaco rilassante. Anche se questo approccio è molto utile, richiede attrezzature costose. Inoltre, le contrazioni isometriche non assomigliano alle contrazioni spontanee simili all’onda del miometrio che si verificano naturalmente nell’utero intatto. In modo univoco, le onde della miometria uterina nei roditori possono essere visualizzate come motilità del corno uterino quando l’intero tratto riproduttivo (ovaie, ovidotti, utero e vagina) viene mantenuto in una soluzione cuscinetto. Qui, presentiamo un metodo ex vivo per monitorare la motilità spontanea dell’utero murino intatto posto in una piastra Petri contenente buffer Krebs ossigenato. Descriviamo anche un algoritmo di quantificazione della motilità che utilizza il motion tracker MATLAB. Questo nuovo approccio fornisce un’alternativa semplice e meno costosa per testare il potenziale rilassante dei rimedi naturali e dei composti sintetici.

Protocol

Tutte le procedure con animali sono state approvate dall’Institutional Animal Care and Use Committee presso la Indiana University School of Medicine (Indianapolis, IN). 2-5 mesi-vecchio F2-129S-C57BL/6 topi femminili sessualmente maturi sono stati utilizzati nello studio. ATTENZIONE: Garantisci la sicurezza indossando un camice da laboratorio, una maschera e dei guanti quando lavori con animali e materiali biopericolosi. 1. Preparazione della soluzion…

Representative Results

La figura 1 mostra le immagini rappresentative scattate durante l’intera procedura di isolamento del tratto riproduttivo descritta in questo protocollo. Per evitare di contaminare il buffer con la pelliccia, che diminuirebbe la qualità video, abbiamo inumidito il corpo del topo con il 70% di etanolo. Il principale punto di riferimento per la sezione di dissezione del protocollo è quello di trovare la vescica urinaria. L’utero e la vagina saranno situati inferiori alla vescica urinaria….

Discussion

Qui, abbiamo descritto un metodo per valutare la contrattilità spontanea dell’intero tratto riproduttivo del roditore, che include le ovaie, gli ovidotti, le corna uterine e la vagina. Abbiamo usato un metodo simile per dimostrare l’effetto rilassante della fenilofina sulla motilità uterina spontanea¹³, tuttavia in passato non siamo stati in grado di fornire un’analisi quantitativa dei dati. In questo lavoro, abbiamo sviluppato un algoritmo per l’analisi quantitativa dei dati di motilità utiliz…

Materials

Epinephrine hydrochloride	Sigma-Aldrich	E4642
Dulbecco's PBS	Fisher Sceintific	17-512Q
Ethanol 200 PROOF	Decon Laboratories	2701
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
CaCl2 · 2H2O	Sigma-Aldrich	C5080
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S0751
MgCl2  · 6H2O	Sigma-Aldrich	M9272
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6297
Isoflurane, USP	Patterson Veterinary	07-893-2374
Dissecting Extra-Fine-Pointed Precision Splinter Forceps	Fisher Sceintific	13-812-42
Curved Hardened Fine Iris Scissors	Fine Science Tools	14091-09
Dissection High-performance Modular Stereomicroscope	Leica	MZ6
Digital 5 Megapixel Color Microscope Camera with active cooling system	Leica	DFC425 C
Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Sources	Fisher Sceintific	12-562-21
Weigh Boat	Fisher Sceintific	WB30304
Convertors Astound Standard Surgical Gown	Cardinal Health	9515	Small, Medium or Large
Gloves	McKesson Corporation	20-1080	Small, Medium, or Large; powder-free sterile latex or nitrile surgical gloves
Petri Dish	Corning Falcon	351029	100 mm
Petri Dish	Corning Falcon	353001	35 mm
95% O2– 5% CO2 gas mixture	Praxair	MM OXCD5-K
Ear-loop Masks	Valumax International	5430E-PP
DSLR 24.2 MP Camera	Canon	EOS Rebel T6i
MATLAB	MathWorks	N/A	version 2019 or later