Ex vivo metod för att bedöma mus reproduktionsorganen spontan motilitet och en MATLAB-baserade livmodern motion tracking algoritm för data analys

Summary

Uteruskontraktioner är viktiga för välbefinnande hos kvinnor. Emellertid, patologiskt ökad kontraktilitet kan resultera i dysmenorré, särskilt hos yngre kvinnor. Här beskriver vi en enkel ex vivo beredning möjliggör snabb bedömning av effekten av glatt muskelavslappnande medel som kan användas för behandling av dysmenorré.

Abstract

Dysmenorré, eller smärtsam kramper, är det vanligaste symtomet i samband med menstruationer hos kvinnor och dess svårighetsgrad kan hindra kvinnors vardag. Här presenterar vi en enkel och billig metod som skulle vara avgörande för att testa nya läkemedel minskar uterin kontraktilitet. Denna metod utnyttjar den unika förmågan hos hela mus reproduktionsorganen att uppvisa spontan motilitet när den underhålls ex vivo i en petriskål som innehåller syrad Krebs buffert. Denna spontana motilitet liknar den vågliknande kan aktiviteten i den mänskliga livmodern, kallad endometrievågor. För att demonstrera effektiviteten av metoden, vi använde en välkänd livmoder relaxerande läkemedel, epinefrin. Vi visar att den spontana motilitet av hela mus reproduktionsorganen kan snabbt och reversibelt hämmas av 1 μM adrenalin i denna petriskål modell. Dokumentera förändringarna i livmodern motilitet kan lätt göras med hjälp av en vanlig smart telefon eller en sofistikerad digitalkamera. Vi utvecklade en MATLAB-baserad algoritm som möjliggör rörelsespårning för att kvantifiera spontan livmoder motilitetsförändringar genom att mäta graden av livmoder Horns rörelser. En stor fördel med denna ex vivo tillvägagångssätt är att reproduktionsorganen förblir intakt under hela experimentet, bevara alla inneboende intrauterin cellulära interaktioner. Den största begränsningen av detta tillvägagångssätt är att upp till 10-20% av uteri kan uppvisa någon spontan motilitet. Hittills är detta den första kvantitativa ex vivo metoden för att bedöma spontan livmoder motilitet i en petriskål modell.

Introduction

Som ett stort kvinnligt organ, livmodern är avgörande för reproduktion och avgörande för näring av fostret¹. Livmodern består av tre skikt: perimetrium, myometrium och endometrium. Den myometrium är den stora kontraktila skikt av livmodern och spelar en nyckelroll i Foster leverans. Livmoderslemhinnan är det innersta skiktet som kantar livmoderhålan och är nödvändig för embryoimplantation. Hos icke-gravida kvinnor i fertil ålder, endometrieskiktet är utgjutet varje månad i början av menstruationscykeln. Den myometrium aids i denna shedding process genom att bibehålla den spontana kan sammandragningar som behövs för att rensa den nekrotiska endometrievävnad från livmodern¹.

Tyvärr, ökad kan kontraktilitet kan resultera i negativa biverkningar såsom dysmenorré, eller smärtsamma mensvärk. Detta är särskilt sett i unga honor och avkomma kvinnor². Emellertid, dysmenorré är olika för varje kvinna och beror på styrkan i deras kan sammandragningar; starkare sammandragningar är ofta förknippade med känslan av svår kramp³. Myometrial kontraktilitet kan visualiseras med hjälp av livmoder ultraljud och är ofta erkänd som endometrievågor. Förbättrad frisättning av prostaglandiner under menstruation⁴ i en livmoder som genomgår endometriesloustar tros bidra till ökad kan hyperkontraktilitet, vilket resulterar i ischemi och hypoxi av livmoder muskeln och därmed ökad smärta³.

Svår dysmenorré kan hindra den dagliga aktiviteten hos vissa kvinnor och 3 till 33% av kvinnorna har mycket svår smärta, vilket kan orsaka en kvinna att vara sängliggande för 1 till 3 dagar varje menstruationscykel⁵. Dysmenorré är den vanligaste orsaken till gynekologisk morbiditet hos kvinnor i fertil ålder oavsett ålder, nationalitet, och ekonomisk status⁵. Den uppskattade prevalensen av dysmenorré är både hög och varierande, allt från 45% till 93% hos kvinnor i fertil ålder⁵.  Dysmenorré-associerad smärta har en effekt på det dagliga livet för kvinnor och kan resultera i dålig akademisk prestation hos ungdomar, lägre sömnkvalitet, begränsning av dagliga aktiviteter, och humörsvängningar⁵.

Många kvinnor som upplever svår dysmenorré utväg till over-the-counter mediciner för att lindra deras smärta. Sådana over-the-counter mediciner innehåller cyklooxygenas (COX) hämmare som förhindrar bildandet av prostaglandiner⁶. Emellertid, COX-hämmare är förknippade med ogynnsamma kardiovaskulära händelser, och om 18% av kvinnor med dysmenorré svarar inte på dessa hämmare⁷. Därför, det finns ett behov av nya mediciner för att minska mensvärk. Eftersom över kontraktilitet av livmodern bidrar till patogenesen av dysmenorré, en möjlig strategi kan vara användningen av uterin relaxantia.

Det är fördelaktigt att kvantifiera effekterna av potentiella relaxerande läkemedel i en modell av naturligt förekommande spontana kan vågliknande sammandragningar. Hittills har dock ingen effektiv ex vivo-metod för att testa muskelavslappnande läkemedel i intakt livmoder beskrivits. För närvarande, isometrisk spänning mätningar används för att utvärdera relaxerande läkemedels effekter. Under sådana mätningar, en livmoder muskel remsor bibehålls vid en konstant längd under förspänning i ett vävnads bad medan kraften i livmodern muskelsammandragningar registreras före och efter oxytocin stimulering i närvaro eller frånvaro av en relaxerande läkemedel. Även om detta tillvägagångssätt är mycket användbart, det kräver dyr utrustning. Dessutom, isometrisk sammandragningar inte liknar den spontana kan vågliknande sammandragningar som naturligt förekommer i intakt livmoder. Unikt, livmoder kan vågor i gnagare kan visualiseras som livmoder horn motilitet när hela reproduktionsorganen (äggstockar, ovikanaler, livmoder, och vagina) upprätthålls i en buffertlösning. Här presenterar vi en ex vivo-metod för att övervaka den spontana motiliteten hos den intakt mus livmodern placerad i en petriskål som innehåller syrad Krebs buffert. Vi beskriver också en motilitetskvantifieringsalgoritm som utnyttjar MATLAB motion tracker. Denna nya metod ger ett enkelt och billigare alternativ för att testa den relaxerande potentialen hos naturligt förekommande rättsmedel och syntetiska föreningar.

Protocol

Alla procedurer med djur har godkänts av den institutionella djuromsorg och användning kommittén vid Indiana University School of Medicine (Indianapolis, IN). 2-5 månad gamla F2-129S-C57BL/6 sexuellt-mogna kvinnliga möss användes i studien. Försiktighet: Säkerställ säkerheten genom att bära en labbrock, mask och handskar när du arbetar med djur och biologiskt farliga material. 1. beredning av lösningen Förbered Krebs buffert,…

Representative Results

Bild 1 visar representativa bilder tagna under hela reproduktionsorgan isolerings proceduren som beskrivs i detta protokoll. För att undvika kontaminering av bufferten med päls, vilket skulle minska videokvaliteten, fuktade vi mus kroppen med 70% etanol. Det viktigaste riktmärket för dissekeringsdelen av protokollet är att hitta urinblåsan. Livmodern och slidan kommer att lokaliseras sämre än urinblåsan. För att testa protokollet, behandlade vi hela repr…

Discussion

Här beskrev vi en metod för att bedöma spontan kontraktilitet av hela gnagare reproduktionsorgan, som omfattar äggstockarna, ovikanaler, livmoder horn, och slidan. Vi använde en liknande metod för att demonstrera den relaxerande effekten av fenylefrin på spontan livmoder motilitet¹³, men tidigare kunde vi inte ge kvantitativ analys av data. I detta arbete utvecklade vi en algoritm för kvantitativ motilitet dataanalys med hjälp av MATLAB motion tracking module. Detta är en användbar tekn…

Materials

Epinephrine hydrochloride	Sigma-Aldrich	E4642
Dulbecco's PBS	Fisher Sceintific	17-512Q
Ethanol 200 PROOF	Decon Laboratories	2701
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
CaCl2 · 2H2O	Sigma-Aldrich	C5080
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S0751
MgCl2  · 6H2O	Sigma-Aldrich	M9272
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6297
Isoflurane, USP	Patterson Veterinary	07-893-2374
Dissecting Extra-Fine-Pointed Precision Splinter Forceps	Fisher Sceintific	13-812-42
Curved Hardened Fine Iris Scissors	Fine Science Tools	14091-09
Dissection High-performance Modular Stereomicroscope	Leica	MZ6
Digital 5 Megapixel Color Microscope Camera with active cooling system	Leica	DFC425 C
Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Sources	Fisher Sceintific	12-562-21
Weigh Boat	Fisher Sceintific	WB30304
Convertors Astound Standard Surgical Gown	Cardinal Health	9515	Small, Medium or Large
Gloves	McKesson Corporation	20-1080	Small, Medium, or Large; powder-free sterile latex or nitrile surgical gloves
Petri Dish	Corning Falcon	351029	100 mm
Petri Dish	Corning Falcon	353001	35 mm
95% O2– 5% CO2 gas mixture	Praxair	MM OXCD5-K
Ear-loop Masks	Valumax International	5430E-PP
DSLR 24.2 MP Camera	Canon	EOS Rebel T6i
MATLAB	MathWorks	N/A	version 2019 or later