Método Ex Vivo para evaluar la motilidad espontánea del tracto reproductivo de ratón y un algoritmo de seguimiento de movimiento del útero basado en MATLAB para el análisis de datos
Summary
Las contracciones uterinas son importantes para el bienestar de las hembras. Sin embargo, el aumento patológicamente de la contractilidad puede resultar en dismenorrea, especialmente en las hembras más jóvenes. Aquí, describimos una preparación ex vivo simple que permite una evaluación rápida de la eficacia de los relajantes musculares lisos que se pueden utilizar para el tratamiento de la dismenorrea.
Abstract
La dismenorrea, o calambres dolorosos, es el síntoma más común asociado con la menstruación en las mujeres y su gravedad puede obstaculizar la vida cotidiana de las mujeres. Aquí, presentamos un método fácil y barato que sería instrumental para probar nuevos fármacos disminuyendo la contractilidad uterina. Este método utiliza la capacidad única de todo el tracto reproductivo del ratón para exhibir motilidad espontánea cuando se mantiene ex vivo en una placa Petri que contiene tampón Krebs oxigenado. Esta motilidad espontánea se asemeja a la actividad miometrial similar a una onda del útero humano, conocida como ondas endometriales. Para demostrar la eficacia del método, empleamos un conocido medicamento relajante uterino, la epinefrina. Demostramos que la motilidad espontánea de todo el tracto reproductivo del ratón puede ser inhibida de forma rápida y reversible por 1 m de epinefrina en este modelo de plato Petri. Documentar los cambios de la motilidad uterina se puede hacer fácilmente usando un teléfono inteligente ordinario o una sofisticada cámara digital. Desarrollamos un algoritmo basado en MATLAB que permite el seguimiento del movimiento para cuantificar los cambios espontáneos de motilidad uterina midiendo la velocidad de los movimientos del cuerno uterino. Una ventaja importante de este enfoque ex vivo es que el tracto reproductivo permanece intacto durante todo el experimento, preservando todas las interacciones celulares intrauterinas intrínsecas. La principal limitación de este enfoque es que hasta el 10-20% de los úteros puede no presentar motilidad espontánea. Hasta ahora, este es el primer método cuantitativo ex vivo para evaluar la motilidad uterina espontánea en un modelo de plato Petri.
Introduction
Como un órgano femenino importante, el útero es crucial para la reproducción y esencial para la nutrición del feto1. El útero consta de tres capas: perimetrio, miometrio y endometrio. El miometrio es la principal capa contráctea del útero y desempeña un papel clave en el parto del feto. El endometrio es la capa más interna que recubre la cavidad uterina y es esencial para la implantación de embriones. En las mujeres no embarazadas en edad reproductiva, la capa endometrial se desprende mensualmente al comienzo del ciclo menstrual. El miometrio ayuda en este proceso de desprendimiento manteniendo las contracciones miometriales espontáneas necesarias para eliminar el tejido endometrial necrótico del útero1.
Desafortunadamente, aumento de la contractilidad miometrial puede resultar en efectos secundarios negativos como dismenorrea, o calambres menstruales dolorosos. Esto se ve especialmente en las mujeres jóvenes y las mujeres nulosa22. Sin embargo, la dismenorrea es diferente para cada mujer y depende de la fuerza de sus contracciones miometriales; contracciones más fuertes se asocian a menudo con la sensación de calambres graves3. La contractilidad miometrial se puede visualizar mediante ultrasonido uterino y a menudo se reconoce como ondas endometriales. Se cree que la liberación mejorada de prostaglandinas durante la menstruación4 en un útero sometido a desprendimiento de endometrio contribuye a aumentar la hipercontractilidad miometrial, lo que resulta en isquemia e hipoxia del músculo uterino y, por lo tanto, aumenta dolor3.
La dismenorrea grave puede obstaculizar la actividad diaria de algunas mujeres y entre el 3 y el 33% de las mujeres tienen dolormuy intenso, lo que podría causar que una mujer esté en cama durante 1 a 3 días cada ciclo menstrual 5. La dismenorrea es la principal causa de morbilidad ginecológica en mujeres en edad reproductiva independientemente de su edad, nacionalidad y situación económica5. La prevalencia estimada de dismenorrea es alta y variable, oscilando entre el 45% y el 93% en mujeres en edad reproductiva5. El dolor asociado a la dismenorrea tiene un efecto en la vida diaria de las mujeres y puede resultar en un bajo rendimiento académico en adolescentes, menor calidad del sueño, restricción de las actividades diarias, y cambios de humor5.
Muchas mujeres que experimentan dismenorrea grave recurren a medicamentos de venta libre para aliviar su dolor. Estos medicamentos de venta libre contienen inhibidores de la ciclooxigenasa (COX) que previenen la formación de prostaglandinas6. Sin embargo, los inhibidores de la COX están asociados con eventos cardiovasculares adversos, y alrededor del 18% de las mujeres con dismenorrea no responden a estos inhibidores7. Por lo tanto, hay una necesidad de nuevos medicamentos para reducir los calambres menstruales. Dado que la contraetimididad del útero contribuye a la patogénesis de la dismenorrea, una posible estrategia puede ser el uso de relajantes uterinos.
Es beneficioso cuantificar los efectos de los medicamentos relajantes potenciales en un modelo de contracciones espontáneas de ondas miometriales de origen natural. Sin embargo, hasta ahora, no se ha descrito ningún método ex vivo eficiente para probar fármacos relajantes musculares en el útero intacto. Actualmente, las mediciones de tensión isométrica se utilizan para evaluar los efectos del fármaco relajante. Durante estas mediciones, una tira muscular uterina se mantiene a una longitud constante bajo precarga en un baño de tejido, mientras que la fuerza de las contracciones del músculo uterino se registra antes y después de la estimulación de la oxitocina en presencia o ausencia de un medicamento relajante. Aunque este enfoque es muy útil, requiere equipos costosos. Además, las contracciones isométricas no se asemejan a las contracciones espontáneas similares a las ondas miometriales que se producen naturalmente en el útero intacto. De manera única, las ondas miometriales uterinas en roedores se pueden visualizar como motilidad del cuerno uterino cuando todo el tracto reproductivo (ovarios, oviductos, útero y vagina) se mantiene en una solución tampón. Aquí, presentamos un método ex vivo para monitorear la motilidad espontánea del útero intacto del ratón colocado en una placa Petri que contiene tampón Krebs oxigenado. También describimos un algoritmo de cuantificación de motilidad utilizando el rastreador de movimiento MATLAB. Este enfoque novedoso proporciona una alternativa fácil y menos costosa para probar el potencial relajante de remedios naturales y compuestos sintéticos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, describimos un método para evaluar la contractilidad espontánea de todo el tracto reproductivo de los roedores, que incluye los ovarios, oviductos, cuernos uterinos y la vagina. Utilizamos un método similar para demostrar el efecto relajante de la fenilefrina en la motilidad uterina espontánea13, sin embargo, en el pasado no pudimos proporcionar análisis cuantitativos de los datos. En este trabajo, desarrollamos un algoritmo para el análisis cuantitativo de datos de motilidad utilizan…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por fondos internos de IU. AGO concibió el estudio. XC y AGO participaron en el diseño de los experimentos descritos. FL y AGO analizaron e interpretaron los datos. KLL, JOB, FL realizaron todos los experimentos ex vivo. FL escribió el script MATLAB. KLL, JOB y AGO escribieron el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron la versión final del manuscrito.
Materials
| Epinephrine hydrochloride | Sigma-Aldrich | E4642 | |
| Dulbecco's PBS | Fisher Sceintific | 17-512Q | |
| Ethanol 200 PROOF | Decon Laboratories | 2701 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| CaCl2 · 2H2O | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| MgCl2 · 6H2O | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Isoflurane, USP | Patterson Veterinary | 07-893-2374 | |
| Dissecting Extra-Fine-Pointed Precision Splinter Forceps | Fisher Sceintific | 13-812-42 | |
| Curved Hardened Fine Iris Scissors | Fine Science Tools | 14091-09 | |
| Dissection High-performance Modular Stereomicroscope | Leica | MZ6 | |
| Digital 5 Megapixel Color Microscope Camera with active cooling system | Leica | DFC425 C | |
| Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Sources | Fisher Sceintific | 12-562-21 | |
| Weigh Boat | Fisher Sceintific | WB30304 | |
| Convertors Astound Standard Surgical Gown | Cardinal Health | 9515 | Small, Medium or Large |
| Gloves | McKesson Corporation | 20-1080 | Small, Medium, or Large; powder-free sterile latex or nitrile surgical gloves |
| Petri Dish | Corning Falcon | 351029 | 100 mm |
| Petri Dish | Corning Falcon | 353001 | 35 mm |
| 95% O2– 5% CO2 gas mixture | Praxair | MM OXCD5-K | |
| Ear-loop Masks | Valumax International | 5430E-PP | |
| DSLR 24.2 MP Camera | Canon | EOS Rebel T6i | |
| MATLAB | MathWorks | N/A | version 2019 or later |
References
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