Summary

Knock-out gene diretto delle cellule staminali neurali del midollo spinale ad axolotl tramite elettroporazione dei complessi CAS9 Protein-gRNA

Published: July 09, 2019
doi:

Summary

Presentato qui è un protocollo per eseguire il knock-out genico limitato nel tempo e nello spazio nei midollo spinale axolotl iniettando il complesso CAS9-gRNA nel canale centrale del midollo spinale seguito dall’elettroporazione.

Abstract

L’axolotl ha la capacità unica di rigenerare completamente il suo midollo spinale. Ciò è in gran parte dovuto alle cellule ependymal rimaste come cellule staminali neurali (NSC) per tutta la vita, che proliferano per riformare il tubo ependymal e si differenziano in neuroni persi dopo la lesione del midollo spinale. Decifrare come queste NSC mantengono la pluripotenza post-sviluppo e proliferano sulla lesione del midollo spinale per riformare l’esatta struttura pre-infortunio può fornire preziose informazioni su come i midollo spinale dei mammiferi possono rigenerarsi e sulle potenziali opzioni di trattamento. L’esecuzione di eliminazioni genetiche in sottoinsiemi specifici di NSC in un periodo di tempo limitato consentirà di studiare i meccanismi molecolari alla base di questi processi rigenerativi, senza essere confusi dagli effetti perturbanti dallo sviluppo. Qui è descritto un metodo per eseguire il knock-out genico negli NSC axolotl del midollo spinale utilizzando il sistema CRISPR-Cas9. Iniettando il complesso CAS9-gRNA nel canale centrale del midollo spinale seguito dall’elettroporazione, i geni bersaglio vengono eliminati nelle NSC all’interno di specifiche regioni del midollo spinale in un momento desiderato, consentendo studi molecolari delle NSC del midollo spinale durante Rigenerazione.

Introduction

Il midollo spinale della maggior parte dei vertebrati non è in grado di rigenerarsi dopo lesioni, portando a disabilità permanente. Diverse salamandre, come l’axolotl, sono eccezioni degne di nota. L’axolotl può rigenerare completamente un midollo spinale strutturalmente identico e ripristinare completamente la funzione del midollo spinale. Gran parte della capacità rigenerativa del midollo spinale axolotl è dovuta alle cellule ependymal. Queste cellule allineano il canale centrale, e a differenza di quelle nei mammiferi, le cellule ependymal axolotli rimangono come cellule staminali neurali (NSC) sviluppo post-embrionale. Dopo la lesione del midollo spinale (ad esempio, da un’amputazione della coda), queste NSC proliferano per far ricrescere il tubo ependymal e differenziarsi per sostituire i neuroni perduti1,2,3. Scoprire come le NSC axolotl spinal cord rimangono pluripotenti e si attivano dopo la lesione può fornire preziose informazioni sullo sviluppo di nuove strategie terapeutiche per i pazienti umani.

A causa dei progressi nella tecnica di knock-out del gene CRISPR-Cas9, l’esecuzione di knock-out per decifrare la funzione genica è diventata più facile ed è stato dimostrato di avere un’ampia applicabilità in varie specie, tra cui axolotls4,5, 6 È possibile: , 7 (in questo stato , 8. Il recente rilascio dell’intero genoma axolotl e del trascrittoma consente ora di prendere di mira qualsiasi locus genomico e di valutare meglio gli effetti fuori target9,10,11,12 , 13 del sistema , 14.Sono stati sviluppati protocolli ottimizzati per knock-out e knock-in in axolotls utilizzando il sistema CRISPR-Cas915. La consegna del macchinario CRISPR-Cas9 sotto forma di proteina-gRNA ribonucleoproteina CAS9 (RNP) ha dimostrato di essere più efficiente rispetto all’utilizzo di Cas9 e plasmidi di codifica gRNA4. Ciò è probabilmente dovuto al fatto che il RNP è di dimensioni inferiori rispetto ai vettori plasmici, alla sua capacità di creare immediatamente le rotture del DNA e alla protezione del gRNA dalla degradazione dell’RNA. Inoltre, l’utilizzo di RNP bypassa la trascrizione e la traduzione; così, evita problemi come la forza promotrice e l’uso ottimale di codone quando gli elementi plasmidi sono derivati da una specie diversa.

Gli studi sulla perdita di funzione sono uno degli approcci generali allo studio delle potenziali funzioni dei geni di interesse. Per studiare la funzione genica durante la rigenerazione, un knock-out dovrebbe idealmente essere eseguito appena prima di una lesione per evitare effetti sullo sviluppo. Inoltre, l’eliminazione dovrebbe essere limitata sia alle NSC che alla regione di rigenerazione. Un knock-out del gene bersaglio in tutte le NSC (comprese quelle nel cervello, come nel caso dei sistemi Cre-LoxP), può produrre effetti non correlati alla rigenerazione che possono confondere l’interpretazione dei risultati. Fortunatamente, la struttura del midollo spinale axolotl offre un’opportunità unica per l’eliminazione limitata di tempo e spazio nelle NSC. La maggior parte delle NSC del midollo spinale sono in contatto con il canale centrale e costituiscono la stragrande maggioranza delle cellule a contatto con il canale centrale16,17. Pertanto, un’iniezione del complesso CAS9-gRNA nel canale centrale, seguita da elettroporazione, consente la consegna agli NSC del midollo spinale in una regione desiderata in un momento specifico4,18,19. Questo protocollo dimostra come questo viene eseguito, portando ad altamente penetrante knock-out nelle NSC midollo del midollo spinale.

Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali devono essere effettuati in conformità con le normative locali e nazionali in materia di sperimentazione animale e con l’approvazione del comitato di revisione istituzionale competente. 1. Preparazione del mix DI RNP CAS9-gRNA Progettare e sintetizzare gRNA.NOTA: fare riferimento ad altre pubblicazioni per la progettazione e la sintesi di gRNA, inclusa una esclusivamente relativa agli axolotl15,<sup class="xr…

Representative Results

L’iniezione e l’elettroporazione del complesso DI CAS9-gRNA contro Sox2 nel canale centrale del midollo spinale axolotl hanno portato a una massiccia perdita di immunoreattività SOX2 nella maggior parte delle NSC del midollo spinale, con gRNA contro la tirosinasi (Tyr) come controllo (Figura 2) come controllo(Figura 2) A). B3-tubulina (macchiata con TUJ1) è un marcatore per i neuroni e non è stato espresso nelle NSC, e le cellule SOX2- TUJ1- che circondano il can…

Discussion

Il protocollo descritto consente l’abbattimento del gene limitato di tempo e spazio nelle NSC nel midollo spinale axolotl. Il protocollo corrente consente il targeting specifico delle NSC a un’ora e una posizione definite con elevata penetrazione. Evita potenziali effetti indesiderati derivanti dall’eliminazione genica nelle NSC in altre regioni come il cervello che si verificano quando si utilizza il sistema Cre-LoxP. Evita inoltre effetti di sviluppo derivanti da un knock-out persistente, consentendo lo studio della fu…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo la prof.ssa Elly M. Tanaka per il suo continuo e lungo supporto. Questo lavoro è stato sostenuto da una National Natural Science Foundation of China (NSFC) Grant (317716), Research Starting Grants della South China Normal University (S82111 e 8S0109), e un China Postdoctoral Science Foundation Grant (2018M633067).

Materials

Agarose Sigma-Aldrich A9539
Benzocaine Sigma-Aldrich E1501-100G
Benzocaine 0.03 % (wt/vol) Mix 500 ml of 10× TBS, 500 ml of 400% (wt/vol) Holtfreter’s solution and 30 ml of 10% (wt/vol) benzocaine stock solution. Fill up the volume to 10 L with dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.
Benzocaine 10 % (wt/vol) Mix 50 g of benzocaine in 500 ml of 100% (vol/vol) ethanol. The solution can be stored at room temperature for up to 12 months.
Borosilicate glass capillaries 1.2 mm O.D., 0.94 mm I.D. Stutter Instrument  BF120-94-8
CaCl2·2H2O Merck 102382
CAS9 buffer, 10x Mix 200 mM HEPES and 1.5 M KCl in RNase-free water. Adjust pH to 7.5. Filter sterilize, aliquot and store at −20 °C for up to 24 months
CAS9-NLS protein   PNA Bio CP03
Cell culture dishes, 10cm Falcon 351029
Dumont #5 – Fine Forceps Fine Scientific Instruments 11254-20
Electroporator Nepa Gene  NEPA21
BEX Pulse Generator CUY21EDIT II
Fast Green FCF Sigma-Aldrich F7252-5G
Fast Green FCF Solution, 5x Dissolve 12.5 mg of Fast Green FCF powder in 10 mL of 1× PBS.
Flaming/Brown Micropipette Puller  Stutter Instrument  P-97
Holtfreter’s solution 400% (wt/vol)  Dissolve 11.125 g of MgSO4·7H2O, 5.36 g of CaCl2·2H2O, 158.4 g of NaCl and 2.875 g of KCl in 10 L of dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.
KCl Merck 104936
MgSO4·7H2O Merck 105886
Microloader pipette tips Eppendorf 5242956003
Micromanipulator  Narishige MN-153 
NaCl Merck 106404
Pneumatic PicoPump World Precision Instruments  SYS-PV830
Ring Forceps Fine Scientific Instruments 11103-09
Stereomicroscope Olympus SZX10 
Tris base Sigma-Aldrich T6066
Tris-buffered saline, 10x Dissolve 24.2 g of Tris base and 90 g of NaCl in 990 ml of dH2O. Adjust pH to 8.0 by adding 10 ml of 37% (vol/vol) HCl. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.
Tweezers w/Variable Gap 2 Round Platinum Plate Electrode, 10mm diameter Nepa Gene  CUY650P10

References

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Citer Cet Article
Lou, W. P., Wang, L., Long, C., Liu, L., Fei, J. Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes. J. Vis. Exp. (149), e59850, doi:10.3791/59850 (2019).

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