CAS9タンパク質-gRNA複合体のエレクトロポレーションによるアクソロトル脊髄神経幹細胞の直接遺伝子ノックアウト
Summary
ここに提示されるプロトコルは、CAS9-gRNA複合体を脊髄中央管に注入し、続いてエレクトロポレーションを行うことによって、軸総便脊髄の時間および空間制限遺伝子ノックアウトを行うプロトコルである。
Abstract
軸次は脊髄を完全に再生する独特な機能を有する。これは主に、生涯を通じて神経幹細胞(NSC)として残存するエペンディマル細胞が、エペンディマルチューブを改変し、脊髄損傷後に失われたニューロンに分化するために増殖するためである。これらのNSCが発達後に多能性を維持し、脊髄損傷時に増殖する方法を解読し、正確な損傷前の構造を改革することで、哺乳類の脊髄がどのように再生できるか、また潜在的な治療選択肢に関する貴重な洞察を提供することができます。限られた期間内にNSCの特定のサブセットで遺伝子ノックアウトを行うことで、開発摂動効果に惑わされることなく、これらの再生プロセスの背後にある分子機構の研究が可能になります。ここで説明するCRISPR-Cas9システムを用いて軸次脊髄NSCで遺伝子ノックアウトを行う方法である。CAS9-gRNA複合体を脊髄中央管路に注入し、その後エレクトロポレーションを行うことで、標的遺伝子は所望の時点で脊髄の特定の領域内のNSCでノックアウトされ、期間中に脊髄NSCの分子研究が可能になります。再生。
Introduction
ほとんどの脊椎動物の脊髄は、損傷後に再生することができず、永久的な障害につながる。アクソロトルのようないくつかのサラマンダーは、顕著な例外です。アクソロtlは構造的に同一の脊髄を完全に再生し、脊髄機能を完全に回復させることができる。軸次脊髄の再生能力の多くは、エペンディマル細胞によるものです。これらの細胞は中央運河に並び、哺乳類とは異なり、軸三ロットエペンディマル細胞は胚発生後の神経幹細胞(NSC)として残ります。脊髄損傷(例えば、尾切断から)の後、これらのNSCは、エペンディマルチューブを再成長させ、失われたニューロン1、2、3を置き換えるために分化するために増殖する。アクソロtl脊髄NSCが多能性であり、損傷後に活性化される方法を明らかにすると、ヒト患者の新しい治療戦略の開発に関する貴重な情報を提供することができます。
CRISPR-Cas9遺伝子ノックアウト技術の進歩により、遺伝子機能を解読するためのノックアウトを行うことが容易になり、アキセロチル4、5を含む様々な種で幅広い適用性を有することが示されている。6,7,8.完全なアクソロトルゲノムとトランスクリプトームの最近のリリースは、現在、任意のゲノム遺伝子座を標的にし、より良いオフターゲット効果9、10、11、12を評価することができます,13歳,14.CRISPR-Cas9システム15を使用してアクセオロチルのノックアウトおよびノックイン用に最適化されたプロトコルが開発されました。CAS9タンパク質-gRNAリボヌクレオタンパク質(RNP)の形態でのCRISPR-Cas9機械の送達は、Cas9およびgRNAコードプラスミド4を使用するよりも効率的であることが示された。これは、RNPがプラスミドベクターよりもサイズが小さく、DNA切断をすぐに作成する能力、およびRNA分解からgRNAを保護するためである可能性があります。さらに、RMP を使用すると、転写と変換をバイパスします。したがって、プラスミド要素が異なる種から派生した場合、プロモーター強度や最適なコドン使用量などの問題を回避します。
機能喪失研究は、対象遺伝子の潜在的な機能を調査するための一般的なアプローチの一つです。再生中の遺伝子機能を研究するためには、発達への影響を避けるために、損傷の直前にノックアウトを行うのが理想的です。さらに、ノックアウトは NSC と再生領域の両方に制限する必要があります。すべてのNSC(Cre-LoxPシステムの場合)における標的遺伝子のノックアウトは、結果の解釈を混乱させる可能性のある再生に関連しない効果を生み出す可能性があります。幸いなことに、軸総進脊髄の構造はNSCの時間およびスペース制限されたノックアウトのための独特な機会を提供する。脊髄NSCのほとんどは中央管と接触し、中央運河16、17と接触する細胞の大部分を構成する。したがって、CAS9-gRNA複合体を中央運河に注入し、続いてエレクトロポレーションを行い、特定の時間4、18、19における所望の領域における脊髄NSCへの送達を可能にする。このプロトコルは、これがどのように行われるかを示し、標的脊髄NSCのノックアウトを高度に浸透させ、その後の分析を行い、再生およびNSC行動への影響を研究する。
Protocol
Representative Results
Discussion
記載されたプロトコルは、軸総部脊髄のNSCにおける時間および空間制限遺伝子ノックアウトを可能にする。現在のプロトコルでは、NSC を定義された時間と場所で特定のターゲティングを可能にします。Cre-LoxPシステムを使用する際に発生する脳などの他の領域のNSCの遺伝子ノックアウトに起因する潜在的な望ましくない影響を回避します。また、持続的なノックアウトに起因する発達効果を?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
継続的かつ長期的な支援を賜り、ありがとうございます。この研究は、中国国立自然科学財団(NSFC)助成金(317716)、南中国師範大学(S82111および8S0109)からの研究開始助成金、および中国ポストドクター科学財団助成金(2018M633067)によって支援されました。
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Benzocaine | Sigma-Aldrich | E1501-100G | |
| Benzocaine 0.03 % (wt/vol) | Mix 500 ml of 10× TBS, 500 ml of 400% (wt/vol) Holtfreter’s solution and 30 ml of 10% (wt/vol) benzocaine stock solution. Fill up the volume to 10 L with dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| Benzocaine 10 % (wt/vol) | Mix 50 g of benzocaine in 500 ml of 100% (vol/vol) ethanol. The solution can be stored at room temperature for up to 12 months. | ||
| Borosilicate glass capillaries 1.2 mm O.D., 0.94 mm I.D. | Stutter Instrument | BF120-94-8 | |
| CaCl2·2H2O | Merck | 102382 | |
| CAS9 buffer, 10x | Mix 200 mM HEPES and 1.5 M KCl in RNase-free water. Adjust pH to 7.5. Filter sterilize, aliquot and store at −20 °C for up to 24 months | ||
| CAS9-NLS protein | PNA Bio | CP03 | |
| Cell culture dishes, 10cm | Falcon | 351029 | |
| Dumont #5 – Fine Forceps | Fine Scientific Instruments | 11254-20 | |
| Electroporator | Nepa Gene | NEPA21 | |
| BEX | Pulse Generator CUY21EDIT II | ||
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Fast Green FCF Solution, 5x | Dissolve 12.5 mg of Fast Green FCF powder in 10 mL of 1× PBS. | ||
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Stutter Instrument | P-97 | |
| Holtfreter’s solution 400% (wt/vol) | Dissolve 11.125 g of MgSO4·7H2O, 5.36 g of CaCl2·2H2O, 158.4 g of NaCl and 2.875 g of KCl in 10 L of dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| KCl | Merck | 104936 | |
| MgSO4·7H2O | Merck | 105886 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| NaCl | Merck | 106404 | |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV830 | |
| Ring Forceps | Fine Scientific Instruments | 11103-09 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX10 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Tris-buffered saline, 10x | Dissolve 24.2 g of Tris base and 90 g of NaCl in 990 ml of dH2O. Adjust pH to 8.0 by adding 10 ml of 37% (vol/vol) HCl. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| Tweezers w/Variable Gap 2 Round Platinum Plate Electrode, 10mm diameter | Nepa Gene | CUY650P10 |
References
- O’Hara, C. M., Egar, M. W., Chernoff, E. A. G. Reorganization of the ependyma during axolotl spinal cord regeneration: Changes in intermediate filament and fibronectin expression. Developmental Dynamics. 193 (2), 103-115 (1992).
- Mchedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. Reconstitution of the Central Nervous System During Salamander Tail Regeneration from the Implanted Neurospheres. Plant, Soil and Environment. 916 (8), 197-202 (2012).
- Nordlander, R. H., Singer, M. The role of ependyma in regeneration of the spinal cord in the urodele amphibian tail. Journal of Comparative Neurology. 180 (2), 349-373 (1978).
- Fei, J. F., et al. Tissue- and time-directed electroporation of CAS9 protein–gRNA complexes in vivo yields efficient multigene knock-out for studying gene function in regeneration. npj Regenerative Medicine. 1 (1), 16002 (2016).
- Fei, J. F., et al. CRISPR-mediated genomic deletion of Sox2 in the axolotl shows a requirement in spinal cord neural stem cell amplification during tail regeneration. Stem Cell Reports. 3 (3), 444-459 (2014).
- Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease. Development. 141 (10), 2165-2171 (2014).
- Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration. eLife. 6, (2017).
- Fei, J. -. F., et al. Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 201706855. , (2017).
- Nowoshilow, S., et al. The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators. Nature. 554 (7690), 50-55 (2018).
- Bryant, D. M., et al. A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors. Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).
- Smith, J. J., et al. A chromosome-scale assembly of the axolotl genome. Genome Research. 373548, (2019).
- Smith, J. J., et al. Sal-Site: Integrating new and existing ambystomatid salamander research and informational resources. BMC Genomics. 6, 1-6 (2005).
- Campbell, L. J., et al. et al Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration. Developmental Dynamics. 240 (7), 1826-1840 (2011).
- Stewart, R., et al. Comparative RNA-seq Analysis in the Unsequenced Axolotl: The Oncogene Burst Highlights Early Gene Expression in. the Blastema. PLoS Computational Biology. 9 (3), (2013).
- Fei, J. -. F., et al. Application and optimization of CRISPR–Cas9-mediated genome engineering in axolotl (Ambystoma mexicanum). Nature Protocols. 13 (12), 2908-2943 (2018).
- Holder, N., et al. Continuous growth of the motor system in the axolotl. Journal of Comparative Neurology. 303 (4), 534-550 (1991).
- Tazaki, A., Tanaka, E. M., Fei, J. F. Salamander spinal cord regeneration: The ultimate positive control in vertebrate spinal cord regeneration. Biologie du développement. 432 (1), 63-71 (2017).
- Albors, A. R., Tanaka, E. M. High-Efficiency Electroporation of the Spinal Cord in Larval Axolotl. Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. 1290, 115-125 (2015).
- Albors, A. R., et al. et al Planar cell polarity-mediated induction of neural stem cell expansion during axolotl spinal cord regeneration. eLife. 4, 1-29 (2015).
- Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Graham, D. B., Root, D. E. Resources for the design of CRISPR gene editing experiments. Genome Biology. 16 (1), 260 (2015).
- Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).
