Imagerie intravitale des lymphocytes intraépithéliales dans l'intestin grêle de Murine

Summary

Nous décrivons une méthode pour visualiser gFP-étiquetée IELs utilisant l'imagerie intravitale de l'intestin grêle murine par microscopie confocale de disque de rotation inversée. Cette technique permet le suivi des cellules vivantes dans la muqueuse jusqu'à 4 h et peut être utilisée pour étudier une variété d'interactions intestinales immunisées-épithéliales.

Abstract

Les lymphocytes intraépithéliales exprimant le récepteur des lymphocytes T (IEL) jouent un rôle clé dans la surveillance immunitaire de l'épithélium intestinal. En partie à cause de l'absence d'un ligand définitif pour le récepteur des lymphocytes T, notre compréhension de la régulation de l'activation de l'IEL et de leur fonction in vivo reste limitée. Cela nécessite l'élaboration de stratégies alternatives pour interroger les voies de signalisation impliquées dans la régulation de la fonction IEL et la réactivité de ces cellules au microenvironnement local. Bien que les EI soient largement compris pour limiter la translocation des agents pathogènes, l'utilisation de l'imagerie intravitale a été essentielle pour comprendre la dynamique spatiotemporelle des interactions IEL/épithélial à l'état stable et en réponse aux agents pathogènes invasifs. Ici, nous présentons un protocole pour visualiser le comportement migratoire d'IEL dans la petite muqueuse intestinale d'une souris de journaliste de cellule T de GFP utilisant la microscopie focale focale de laser confocal de disque inversé. Bien que la profondeur maximale d'imagerie de cette approche soit limitée par rapport à l'utilisation de la microscopie à balayage laser à deux photons, la microscopie laser confocale du disque tournant offre l'avantage de l'acquisition d'images à haute vitesse avec un blanchiment de photoet et photodamage. À l'aide d'un logiciel d'analyse d'images 4D, le comportement de surveillance des lymphocytes T et leurs interactions avec les cellules voisines peuvent être analysés à la suite d'une manipulation expérimentale afin de fournir un aperçu supplémentaire de l'activation et de la fonction de l'IEL au sein de la muqueuse intestinale.

Introduction

Les lymphocytes intraépithéliales (IEL) sont situés dans l'épithélium intestinal, et se trouvent à la fois le long de la membrane du sous-sol et entre les cellules épithéliales adjacentes dans l'espace intercellulaire latéral¹. Il y a approximativement un IEL pour chaque 5-10 cellules épithéliales ; ces IEL servent de sentinelles pour assurer la surveillance immunitaire de la grande étendue de la barrière épithéliale intestinale². Les IEL exprimant le récepteur des lymphocytes T (TCR) représentent jusqu'à 60 % de la population totale d'IEL dans l'intestin grêle murine. Des études menées sur des souris déficientes en lymp....

Protocol

Toutes les études ont été menées dans une association de l'évaluation et de l'accréditation des soins aux animaux de laboratoire (AALAC) accrédité s'installation selon les protocoles approuvés par Rutgers New Jersey Medical School Comparative Medicine Resources.

1. Préparation de la souris

REMARQUE: La procédure suivante, y compris la préparation des animaux et la chirurgie, prendra 30 à 40 min. Avant la chirurgie, allumer le microscope et réchauffer l'incubateur fermé sur le microscope à 37 oC.

1. Effectuer des expériences sur des souris TcrdEGFP de 8 à 10 semaines sur un fond C57BL/6, ob....

Results

À l'aide de l'imagerie intravitale des souris reporter TcrdEGFP, nous avons déjà montré que les IEL présentent un comportement de surveillance dynamique, dans lequel ils patrouillent l'épithélium en migrant le long de la membrane du sous-sol et dans l'espace intercellulaire latéral (LIS) à stable état (Figure 2, Film 1).

Cette approche peut également être utilisée pour évaluer comment l'inhibition de voies de signalisation cellulaire sédentaires s.......

Discussion

Le développement de techniques de microscopie intravitale a fourni une occasion sans précédent d'observer la réorganisation des structures subcellulaires^8,9,22, interactions cellule-cellule^{12, 25} et le comportement migratoire cellulaire^13,14,15,16

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antenne de 35 mm, n° 1.5 Coverslip	MatTek	P35G-1.5-14-C
Alexa Fluor 633 Hydrazide	Invitrogen	A30634
BD PrecisionGlide Aiguilles hypodermiques - 27 G	Thermo Fisher Scientific	14-826-48
BD Slip Tip Seringue stérile - 1 mL	Thermo Fisher Scientific	14-823-434
BD Seringue à tuberculine	Thermo Fisher Scientific	14-829-9
Ciseaux de dissection	Thermo Fisher Scientific	08-940
Électrocautérisation	Thermo Fisher Scientific	50822501
Chambre d’incubation fermée	OKOLAB
Aiguilles à œil de microscope, taille #3 ; 1/2 cercle, pointe conique, 12 mm Longueur de corde	Roboz	RS-7983-3
Hank’s Solution saline équilibrée	Sigma-Aldrich	55037C
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570
Imaris (v. 9.2.1) avec modules Start, Track, XT	Bitplane		Software
Inversé DMi8	Leica		Microscope
IQ3 (v. 3.6.3)	Andor		Software
Ketamine	Putney		Anesthésie
Kimwipes	VWR	21905-026
McPherson-Vannas ciseaux 3" (7,5 cm) Long 5 x 0,15 mm droit Sharp	Roboz	RS-5600
Suture chirurgicale non résorbable, bobine de soie, tressé noir	Fisher Scientific	NC0798934
Nugent Forceps 4,25" (11 cm) Pointe longue et lisse de 1,2 mm	Roboz	RS-5228
Puralube Vet Ointement	Dechra		Lubrificateur pour les yeux
Disque rotatif Yokogawa CSU-W1 avec un objectif d’immersion glycérol 63x 1,3 N.A. HC PLAN APO, caméra iXon Life 888 EMCCD, laser à diode 405 nm, laser DPSS 488 nm, laser à diode 640 nm	Andor		Système confocal
Xylazine	Akorn		Anesthésie