Intravital Imaging av intraepithelial-lymfocytter i murine tynntarmen
Summary
Vi beskriver en metode for å visualisere GFP-merket γδ IELs bruker intravital Imaging av murine tynntarmen av invertert spinning disk konfokalmikroskopi mikroskopi. Denne teknikken gjør det mulig sporing av levende celler i mucosa for opptil 4 h og kan brukes til å undersøke en rekke intestinal immun-epitel interaksjoner.
Abstract
Intraepithelial-lymfocytter uttrykker γδ T celle reseptor (γδ IEL) spiller en nøkkelrolle i immun overvåkning av tarm epitel. På grunn av mangelen på en definitiv ligand for γδ T celle reseptor, er vår forståelse av reguleringen av γδ IEL aktivering og deres funksjon i vivo fortsatt begrenset. Dette nødvendiggjør utviklingen av alternative strategier for å forhøre signalnettverk trasé involvert i å regulere γδ IEL funksjon og responsen av disse cellene til den lokale mikromiljøet. Selv om γδ IELs er allment forstått å begrense patogen translokasjon, har bruken av intravital Imaging vært avgjørende for å forstå den spatiotemporal dynamikken i IEL/epitel interaksjoner ved steady-state og som svar på invasive patogener. Heri presenterer vi en protokoll for å visualisere IEL trekk atferd i den lille tarmslimhinnen i en GFP γδ T celle reporter musen med invertert spinning disk konfokalmikroskopi laser mikroskopi. Til tross for det maksimum tenkelig dybden av denne adgang er begrenset i forhold til bruken av to-Foton laser-skanning mikroskopi, spinning diskett konfokalmikroskopi laser mikroskopi skaffer fordelen av høy fart image oppkjøpet med nedsatte photobleaching og photoskade. Bruke 4D bildeanalyse programvare, T celle overvåkning atferd og deres interaksjon med nabocellene kan analyseres etter eksperimentell manipulasjon for å gi ytterligere innsikt i IEL aktivisering og funksjon i tarmen mucosa.
Introduction
Intraepithelial-lymfocytter (IEL) ligger innenfor tarm epitel, og finnes både langs kjeller membranen og mellom tilstøtende epitelceller i lateral intercellulære plass1. Det er omtrent en IEL for hver 5-10 epitelceller; disse IELs tjene som Sentinels å gi immun overvåkning av den store hvelvingen av intestinal epitel barriere2. IELs uttrykker γδ T celle reseptor (TCR) utgjør opp til 60% av den totale IEL befolkningen i murine tynntarmen. Studier i γδ T-Cell-mangelfull mus demonstrere en stor grad beskyttende rolle i disse cellene som svar på intestinal skade, betennelser og infeksjoner3,4,5. Til tross for generering av Tcrd knockout Mouse6, vår forståelse av γδ IEL biologi fortsatt begrenset skyldes delvis det faktum at LIGANDER anerkjent av γδ TCR har ennå ikke identifisert7. Som et resultat, har mangelen på verktøy for å studere denne cellen befolkningen gjorde det vanskelig å undersøke rollen som γδ TCR aktivisering og funksjon under fysiologiske og patologiske tilstander. For å fylle dette gapet, har vi utviklet Live Imaging teknikker for å visualisere γδ IEL trekk atferd og interaksjoner med nabo enterocytes som et middel for å gi ytterligere innsikt i γδ IEL funksjon og respons på eksterne stimuli in vivo.
I løpet av det siste tiåret, har intravital Imaging betydelig utvidet vår forståelse av de molekylære hendelser som er involvert i flere fasetter av intestinal biologi, inkludert epitel celle shedding8, regulering av epitel barrierefunksjon9 ,10, myelogen celle prøvetaking av luminal innhold11,12og Host-mikrobe interaksjoner11,13,14,15,16 . I sammenheng med IEL biologi, har bruken av intravital mikroskopi belyse spatiotemporal dynamikk IEL motilitet og faktorene formidling deres overvåking atferd13,14,15, 16i den. Utviklingen av TcrdH2BeGFP (TcrdEGFP) reporter mus, som merker γδ IELs av kjernefysiske GFP uttrykk17, avslørte at γδ IELs er svært aktive innenfor epitel og viser en unik overvåking atferd som er mottakelig for mikrobiell infeksjon17,13,14. Nylig ble en annen γδ T celle reporter mus utviklet (Tcrd-GDL) som uttrykker GFP i cytoplasma å tillate visualisering av hele cellen18. Lignende metodikk har blitt brukt til å undersøke kravet om spesifikke chemokine reseptorer, slik som G protein-koblet reseptor (GPCR)-18 og-55, på dynamikken i IEL motilitet19,20. I fravær av en celle-spesifikk reporter, ble fluorescerende bøyd antistoffer mot CD8α brukt til å visualisere og spore IEL motilitet in vivo19,20. Til tross for to-Foton laserskanning mikroskopi er vanligvis anvendt for intravital tenkelig, bruken av roterer diskett konfokalmikroskopi laser mikroskopi skaffer enestående fordeler å fange høy fart og høy-resolution mange–kanalen profilen med minimal bakgrunnsstøyen. Denne teknologien er ideell for å belyse den spatiotemporal dynamikken av immun/epitel interaksjoner innenfor komplekse mikromiljøet av tarmslimhinnen. Videre, ved bruk av ulike transgene-og/eller knockout-mus modeller, kan disse studiene gi innsikt i den molekylære reguleringen av intestinal immun-og/eller epitel celle funksjon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Utviklingen av intravital mikroskopi teknikker har gitt en enestående mulighet til å observere omorganisering av subcellulære strukturer8,9,22, celle-celle interaksjoner12, 25 og celle trekk atferd13,14,15,16,26…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet er støttet av NIH R21 AI143892, New Jersey Health Foundation Grant, Busch Biomedical Grant (KLE). Vi takker Madeleine Hu for hennes assistanse i å redigere manuskriptet og gi dataene som vises i representative resultater.
Materials
| 35mm dish, No. 1.5 Coverslip | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Alexa Fluor 633 Hydrazide | Invitrogen | A30634 | |
| BD PrecisionGlide Hypodermic needles – 27g | Thermo Fisher Scientific | 14-826-48 | |
| BD Slip Tip Sterile Syringe – 1 ml | Thermo Fisher Scientific | 14-823-434 | |
| BD Tuberculin Syringe | Thermo Fisher Scientific | 14-829-9 | |
| Dissecting scissors | Thermo Fisher Scientific | 08-940 | |
| Electrocautery | Thermo Fisher Scientific | 50822501 | |
| Enclosed incubation chamber | OKOLAB | Microscope | |
| Eye Needles, Size #3; 1/2 Circle, Taper Point, 12 mm Chord Length | Roboz | RS-7983-3 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | 55037C | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
| Imaris (v. 9.2.1) with Start, Track, XT modules | Bitplane | Software | |
| Inverted DMi8 | Leica | Microscope | |
| IQ3 (v. 3.6.3) | Andor | Software | |
| Ketamine | Putney | Anesthesia | |
| Kimwipes | VWR | 21905-026 | |
| McPherson-Vannas scissors 3” (7.5 cm) Long 5X0.15mm Straight Sharp | Roboz | RS-5600 | |
| Non-absorbable surgical suture, Silk Spool, Black Braided | Fisher Scientific | NC0798934 | |
| Nugent Forceps 4.25” (11 cm) Long Angled Smooth 1.2mm Tip | Roboz | RS-5228 | |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | Lubricating Eye Ointment | |
| Spinning disk Yokogawa CSU-W1 with a 63x 1.3 N.A. HC PLAN APO glycerol immersion objective, iXon Life 888 EMCCD camera, 405 nm diode laser, 488 nm DPSS laser, 640 nm diode laser | Andor | Confocal system | |
| Xylazine | Akorn | Anesthesia |
References
- Cheroutre, H., Lambolez, F., Mucida, D. The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 11 (7), 445-456 (2011).
- Hu, M. D., Edelblum, K. L. Sentinels at the frontline: the role of intraepithelial lymphocytes in inflammatory bowel disease. Current Pharmacology Reports. 3 (6), 321-334 (2017).
- Chen, Y., Chou, K., Fuchs, E., Havran, W. L., Boismenu, R. Protection of the intestinal mucosa by intraepithelial gamma delta T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (22), 14338-14343 (2002).
- Swamy, M., et al. Intestinal intraepithelial lymphocyte activation promotes innate antiviral resistance. Nature Communications. 6, 7090 (2015).
- Dalton, J. E., et al. Intraepithelial gammadelta+ lymphocytes maintain the integrity of intestinal epithelial tight junctions in response to infection. Gastroenterology. 131 (3), 818-829 (2006).
- Mombaerts, P., et al. Spontaneous development of inflammatory bowel disease in T cell receptor mutant mice. Cell. 75 (2), 274-282 (1993).
- Willcox, B. E., Willcox, C. R. gammadelta TCR ligands: the quest to solve a 500-million-year-old mystery. Nature Immunology. 20 (2), 121-128 (2019).
- Marchiando, A. M., et al. The epithelial barrier is maintained by in vivo tight junction expansion during pathologic intestinal epithelial shedding. Gastroenterology. 140 (4), e1201-e1202 (2011).
- Marchiando, A. M., et al. Caveolin-1-dependent occludin endocytosis is required for TNF-induced tight junction regulation in vivo. Journal of Cell Biology. 189 (1), 111-126 (2010).
- Yu, D., et al. MLCK-dependent exchange and actin binding region-dependent anchoring of ZO-1 regulate tight junction barrier function. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 107 (18), 8237-8241 (2010).
- Chieppa, M., Rescigno, M., Huang, A. Y., Germain, R. N. Dynamic imaging of dendritic cell extension into the small bowel lumen in response to epithelial cell TLR engagement. Journal of Experimental Medicine. 203 (13), 2841-2852 (2006).
- McDole, J. R., et al. Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine. Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).
- Edelblum, K. L., et al. Dynamic migration of gammadelta intraepithelial lymphocytes requires occludin. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (18), 7097-7102 (2012).
- Edelblum, K. L., et al. gammadelta Intraepithelial Lymphocyte Migration Limits Transepithelial Pathogen Invasion and Systemic Disease in Mice. Gastroenterology. 148 (7), 1417-1426 (2015).
- Hu, M. D., et al. Epithelial IL-15 Is a Critical Regulator of gammadelta Intraepithelial Lymphocyte Motility within the Intestinal Mucosa. Journal of Immunology. 201 (2), 747-756 (2018).
- Hoytema van Konijnenburg, D. P., et al. Intestinal Epithelial and Intraepithelial T Cell Crosstalk Mediates a Dynamic Response to Infection. Cell. 171 (4), 783-794 (2017).
- Prinz, I., et al. Visualization of the earliest steps of gammadelta T cell development in the adult thymus. Nature Immunology. 7 (9), 995-1003 (2006).
- Sandrock, I., et al. Genetic models reveal origin, persistence and non-redundant functions of IL-17-producing gammadelta T cells. Journal of Experimental Medicine. 215 (12), 3006-3018 (2018).
- Wang, X., Sumida, H., Cyster, J. G. GPR18 is required for a normal CD8alphaalpha intestinal intraepithelial lymphocyte compartment. Journal of Experimental Medicine. 211 (12), 2351-2359 (2014).
- Sumida, H., et al. GPR55 regulates intraepithelial lymphocyte migration dynamics and susceptibility to intestinal damage. Sci Immunol. 2 (18), (2017).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2 (2), (2011).
- Watson, A. J., et al. Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers. Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).
- Lodolce, J. P., et al. IL-15 receptor maintains lymphoid homeostasis by supporting lymphocyte homing and proliferation. Immunity. 9 (5), 669-676 (1998).
- Ma, L. J., Acero, L. F., Zal, T., Schluns, K. S. Trans-presentation of IL-15 by intestinal epithelial cells drives development of CD8alphaalpha IELs. Journal of Immunology. 183 (2), 1044-1054 (2009).
- Knoop, K. A., et al. Antibiotics promote the sampling of luminal antigens and bacteria via colonic goblet cell associated antigen passages. Gut Microbes. 8 (4), 400-411 (2017).
- Sujino, T., et al. Tissue adaptation of regulatory and intraepithelial CD4(+) T cells controls gut inflammation. Science. 352 (6293), 1581-1586 (2016).
- Zhang, B., et al. Differential Requirements of TCR Signaling in Homeostatic Maintenance and Function of Dendritic Epidermal T Cells. Journal of Immunology. 195 (9), 4282-4291 (2015).
- Chennupati, V., et al. Intra- and intercompartmental movement of gammadelta T cells: intestinal intraepithelial and peripheral gammadelta T cells represent exclusive nonoverlapping populations with distinct migration characteristics. Journal of Immunology. 185 (9), 5160-5168 (2010).
- Kolesnikov, M., Farache, J., Shakhar, G. Intravital two-photon imaging of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 421, 73-80 (2015).
