Imagem latente intravital de linfócitos intraepithelial no intestino pequeno murine
Summary
Nós descrevemos um método para visualizar o IELS do ltγδ GFP-etiquetado usando a imagem latente intravital do intestino pequeno murino pela microscopia confocal invertida do disco de giro. Esta técnica permite o rastreamento de células ao vivo dentro da mucosa para até 4 h e pode ser usada para investigar uma variedade de interações imunológicas intestinais.
Abstract
Os linfócitos intraepithelial que expressam o receptor da pilha de ltγδ T (ltγδ IEL) jogam um papel chave na fiscalização imune do epitélio intestinal. Devido, em parte, à falta de um ligantes definitivo para o receptor de células ltγδ T, nossa compreensão da regulação da ativação ltγδ IEL e sua função in vivo permanece limitada. Isso requer o desenvolvimento de estratégias alternativas para interrogar as vias de sinalização envolvidas na regulação da função ltγδ IEL e a responsividade dessas células ao microambiente local. Embora os IELS do ltγδ sejam compreendidos extensamente para limitar o translocation do micróbio patogénico, o uso da imagem latente intravital tem sido crítico a compreender a dinâmica armazenamento de interações de IEL/epithelial no estado estacionário e em resposta aos micróbios patogénicos invasores. Nisto, nós apresentamos um protocolo para visualizar o comportamento migratório de IEL na mucosa intestinal pequena de um rato do repórter da pilha de GFP ltγδ T usando a microscopia de laser confocal invertida do disco de giro. Embora a profundidade máxima da imagem latente desta aproximação seja limitada relativo ao uso da microscopia do laser-exploração do dois-fóton, a microscopia confocal do laser do disco de giro fornece a vantagem da aquisição de imagem de alta velocidade com photobranqueamento reduzido e photodamage. Usando o software da análise de imagem 4D, o comportamento da fiscalização da pilha de T e suas interações com pilhas vizinhas podem ser analisados depois da manipulação experimental para fornecer a introspecção adicional na ativação e na função de IEL dentro da mucosa intestinal.
Introduction
Os linfócitos intraepithelial (IEL) são situados dentro do epitélio intestinal, e são encontrados ao longo da membrana do porão e entre pilhas epithelial adjacentes no espaço intercelular lateral1. Há aproximadamente um IEL para cada 5-10 pilhas epithelial; Estes IELs servem como sentinelas para fornecer a fiscalização imune da grande extensão da barreira epithelial intestinal2. Os IELs que expressam o receptor da célula ltγδ T (TCR) compreendem até 60% da população total de IEL no intestino delgado murino. Estudos em camundongos T-Cell-deficientes ltγδ demonstram um papel de grande proteção dessas células em resposta a lesão intestinal, inflamação e infecção3,4,5. Apesar da geração do mouse nocaute Tcrd 6, nossa compreensão da biologia ltγδ IEL permanece limitada devido, em parte, ao fato de que os ligantes reconhecidos pelo ltγδ TCR ainda não foram identificados7. Como resultado, a falta de ferramentas para estudar esta população celular dificultou a investigação do papel da ativação e função do ltγδ TCR condições fisiológicas e patológicas. Para preencher essa lacuna, desenvolvemos técnicas de imagem ao vivo para visualizar o comportamento migratório de ltγδ IEL e interações com enterócitos vizinhos como um meio para fornecer informações adicionais sobre a função ltγδ IEL e responsividade aos estímulos externos in vivo.
Durante a última década, a imagem latente Intravital expandiu significativamente nossa compreensão dos eventos moleculars envolvidos em facetas múltiplas da biologia intestinal, incluindo o derramamento epithelial8da pilha, regulamento da função epithelial 9 da barreira ,10, amostragem de células mielóides de conteúdo Luminal11,12e interações hospedeiro-micróide11,13,14,15,16 . No contexto da biologia de IEL, o uso da microscopia intravital tem derramado luz sobre a dinâmica espaciotemporal da motilidade de IEL e os fatores que mediam o seu comportamento de vigilância13,14,15, a 16. O desenvolvimento de camundongos de repórter TcrdH2BeGFP (TcrdEGFP), que rotula ltγδ IELs pela expressão nuclear de GFP17, revelou que Ltγδ IELS são altamente motile dentro do epitélio e exibem um comportamento de vigilância único que é responsivo a microbiana infecção17,13,14. Recentemente, um outro rato do repórter da pilha de ltγδ T foi desenvolvido (Tcrd-GDL) que expressa GFP no citoplasma para permitir o visualização da pilha inteira18. Metodologia semelhante tem sido utilizada para investigar a exigência de receptores específicos de quimiocina, como o receptor acoplado à proteína G (GPCR)-18 e-55, sobre a dinâmica da motilidade de IEL19,20. Na ausência de um repórter Cell-specific, os anticorpos conjugado fluorescentes de encontro a CD8α foram usados para visualizar e seguir a motilidade de IEL in vivo19,20. Embora a microscopia de varredura do laser do dois-fóton seja usada geralmente para a imagem latente intravital, o uso da microscopia confocal do laser do disco de giro fornece vantagens originais para capturar imagens multicanal de alta velocidade e de alta resolução com ruído de fundo mínimo. Esta tecnologia é ideal para elucidar a dinâmica espaciotemporal das interações imunológicas/epiteliais dentro do complexo microambiente da mucosa intestinal. Além disso, através do uso de vários modelos transgênicos e/ou Knockout mouse, esses estudos podem fornecer informações sobre a regulação molecular da função intestinal imune e/ou células epiteliais.
Protocol
Representative Results
Discussion
O desenvolvimento de técnicas de microscopia intravital proporcionou uma oportunidade inédita de observar a reorganização das estruturas subcelulares8,9,22, interações célula-celular12, 25 e comportamento migratóriocelular 13,14,15,16<…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é apoiado pela NIH R21 AI143892, New Jersey Health Foundation Grant, Busch Biomedical Grant (KLE). Agradecemos a Madeleine Hu por sua ajuda na edição do manuscrito e no fornecimento dos dados mostrados nos resultados representativos.
Materials
| 35mm dish, No. 1.5 Coverslip | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Alexa Fluor 633 Hydrazide | Invitrogen | A30634 | |
| BD PrecisionGlide Hypodermic needles – 27g | Thermo Fisher Scientific | 14-826-48 | |
| BD Slip Tip Sterile Syringe – 1 ml | Thermo Fisher Scientific | 14-823-434 | |
| BD Tuberculin Syringe | Thermo Fisher Scientific | 14-829-9 | |
| Dissecting scissors | Thermo Fisher Scientific | 08-940 | |
| Electrocautery | Thermo Fisher Scientific | 50822501 | |
| Enclosed incubation chamber | OKOLAB | Microscope | |
| Eye Needles, Size #3; 1/2 Circle, Taper Point, 12 mm Chord Length | Roboz | RS-7983-3 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | 55037C | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
| Imaris (v. 9.2.1) with Start, Track, XT modules | Bitplane | Software | |
| Inverted DMi8 | Leica | Microscope | |
| IQ3 (v. 3.6.3) | Andor | Software | |
| Ketamine | Putney | Anesthesia | |
| Kimwipes | VWR | 21905-026 | |
| McPherson-Vannas scissors 3” (7.5 cm) Long 5X0.15mm Straight Sharp | Roboz | RS-5600 | |
| Non-absorbable surgical suture, Silk Spool, Black Braided | Fisher Scientific | NC0798934 | |
| Nugent Forceps 4.25” (11 cm) Long Angled Smooth 1.2mm Tip | Roboz | RS-5228 | |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | Lubricating Eye Ointment | |
| Spinning disk Yokogawa CSU-W1 with a 63x 1.3 N.A. HC PLAN APO glycerol immersion objective, iXon Life 888 EMCCD camera, 405 nm diode laser, 488 nm DPSS laser, 640 nm diode laser | Andor | Confocal system | |
| Xylazine | Akorn | Anesthesia |
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