Intravital Imaging av intraepitelial lymfocyter i murina tunn tarmen
Summary
Vi beskriver en metod för att visualisera GFP-märkta γδ IELs med intravital avbildning av murina tunn tarmen genom inverterad spinning disk konfokalmikroskopi. Denna teknik gör det möjligt att spåra levande celler i slem hinnan i upp till 4 h och kan användas för att undersöka en mängd olika intestinal immun-epitelial interaktioner.
Abstract
Intraepitelial lymfocyter som uttrycker γδ T cell receptor (γδ IEL) spelar en nyckel roll i immun övervakningen av tarm epitelet. Beror delvis på avsaknaden av en definitiv ligand för γδ T cell receptorn, vår förståelse av regleringen av γδ IEL aktivering och deras funktion in vivo förblir begränsad. Detta nödvändiggjorde utvecklingen av alternativa strategier för att förhöra signal vägar inblandade i regleringen γδ IEL funktion och lyhördhet för dessa celler till den lokala mikromiljön. Även om γδ IELs är allmänt förstått att begränsa patogenen translocation, användning av intravital avbildning har varit avgörande för att förstå spatiotemporal dynamiken i IEL/epitelial interaktioner vid Steady-State och som svar på invasiva patogener. Häri presenterar vi ett protokoll för att visualisera IEL migrations beteende i den lilla tarm slem hinnan i en GFP γδ T cell reporter mus med inverterad spinning disk konfokalmikroskopi lasermikroskopi. Även om den maximala Imaging djupet av denna metod är begränsad i förhållande till användningen av två-Photon laser-scanning mikroskopi, spinning disk konfokalmikroskopi lasermikroskopi ger fördelen av hög hastighet bild förvärv med minskad fotoblekning och photodamage. Använda 4D bild analys program vara, T cell övervakning beteende och deras interaktioner med angränsande celler kan analyseras efter experimentell manipulation för att ge ytterligare insikt i IEL aktivering och funktion inom tarm slem hinnan.
Introduction
Intraepitelial lymfocyter (IEL) ligger inom tarm epitel, och finns både längs källaren membranet och mellan angränsande epitelceller i sidled intercellulära rymden1. Det finns ungefär en IEL för varje 5-10 epitelceller; dessa IELs fungerar som vakt poster för att ge immun övervakning av den stora vidden av intestinal epitelial barriär2. IELs uttrycker γδ T cell receptor (TCR) omfattar upp till 60% av den totala IEL populationen i murina tunn tarmen. Studier på möss med γδ T-cells brist uppvisar en till stor del skyddande roll för dessa celler som svar på tarm skador, inflammation och infektion3,4,5. Trots generering av Tcrd knockout Mouse6, är vår förståelse av γδ IEL biologi begränsad beror delvis på det faktum att ligander som erkänts av γδ TCR ännu inte har identifierats7. Som ett resultat av bristen på verktyg för att studera denna cell population har gjort det svårt att undersöka vilken roll γδ TCR aktivering och funktion under fysiologiska och sjukdoms tillstånd. För att fylla denna lucka, har vi utvecklat Live Imaging tekniker för att visualisera γδ IEL flyttande beteende och interaktioner med angränsande enterocyter som ett sätt att ge ytterligare insikt i γδ IEL funktion och lyhördhet för yttre stimuli in vivo.
Under det senaste decenniet, intravital Imaging har avsevärt utökat vår förståelse av molekyl ära händelser inblandade i flera aspekter av intestinal biologi, inklusive epitelial cell shedding8, reglering av epitelial barriär funktion9 ,10, myeloisk cell provtagning av Luminal innehåll11,12och Host-Microbe interaktioner11,13,14,15,16 . I samband med IEL biologi, har användningen av intravital mikroskopi belysa spatiotemporal dynamiken i IEL motilitet och de faktorer som medierar deras övervakning beteende13,14,15, och 16. Utvecklingen av TcrdH2BeGFP (TcrdEGFP) reporter möss, som etiketter γδ IELs av nukleära GFP uttryck17, visade att γδ iels är mycket rörliga inom epitelet och uppvisar en unik övervakning beteende som är lyhörd för mikrobiell infektion17,13,14. Nyligen, en annan γδ T cell reporter mus utvecklades (Tcrd-GDL) som uttrycker GFP i cytoplasman att möjliggöra visualisering av hela cellen18. Liknande metod har använts för att undersöka kravet på specifika chemokine receptorer, såsom G proteinkopplad receptor (GPCR)-18 och-55, på dynamiken i IEL motilitet19,20. I avsaknad av en cellspecifik reporter användes fluorescerande konjugerade anti kroppar mot CD8α för att visualisera och spåra IEL motilitet in vivo19,20. Fastän två-Photon lasern avsökningen mikroskopi är vanligen använd för intravital tänkbar, den använda av snurrande bricka konfokalmikroskopi lasern mikroskopi skaffar unik forellerna till ta till fånga hög fart och hög-beslutsamhet många–kanal profilen med minimal bakgrunden buller. Denna teknik är idealisk för att belysa den spatiotemporal dynamiken i immun/epitelial interaktioner inom den komplexa mikromiljön i tarm slem hinnan. Dessutom, genom användning av olika transgena och/eller knockout mus modeller, dessa studier kan ge insikt i den molekyl ära regleringen av intestinal immun-och/eller epitelceller funktion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Utvecklingen av intravital mikroskopi tekniker har gett en oöverträffad möjlighet att observera om organisation av subcellulära strukturer8,9,22, cell-cell interaktioner12, 25 och cell flytt beteende13,14,15,16,<sup class="xref"…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av NIH R21 AI143892, New Jersey Health Foundation Grant, Busch biomedicinska Grant (KLE). Vi tackar Madeleine hu för hennes hjälp med att redigera manuskriptet och tillhandahålla de uppgifter som visas i de representativa resultaten.
Materials
| 35mm dish, No. 1.5 Coverslip | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Alexa Fluor 633 Hydrazide | Invitrogen | A30634 | |
| BD PrecisionGlide Hypodermic needles – 27g | Thermo Fisher Scientific | 14-826-48 | |
| BD Slip Tip Sterile Syringe – 1 ml | Thermo Fisher Scientific | 14-823-434 | |
| BD Tuberculin Syringe | Thermo Fisher Scientific | 14-829-9 | |
| Dissecting scissors | Thermo Fisher Scientific | 08-940 | |
| Electrocautery | Thermo Fisher Scientific | 50822501 | |
| Enclosed incubation chamber | OKOLAB | Microscope | |
| Eye Needles, Size #3; 1/2 Circle, Taper Point, 12 mm Chord Length | Roboz | RS-7983-3 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | 55037C | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
| Imaris (v. 9.2.1) with Start, Track, XT modules | Bitplane | Software | |
| Inverted DMi8 | Leica | Microscope | |
| IQ3 (v. 3.6.3) | Andor | Software | |
| Ketamine | Putney | Anesthesia | |
| Kimwipes | VWR | 21905-026 | |
| McPherson-Vannas scissors 3” (7.5 cm) Long 5X0.15mm Straight Sharp | Roboz | RS-5600 | |
| Non-absorbable surgical suture, Silk Spool, Black Braided | Fisher Scientific | NC0798934 | |
| Nugent Forceps 4.25” (11 cm) Long Angled Smooth 1.2mm Tip | Roboz | RS-5228 | |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | Lubricating Eye Ointment | |
| Spinning disk Yokogawa CSU-W1 with a 63x 1.3 N.A. HC PLAN APO glycerol immersion objective, iXon Life 888 EMCCD camera, 405 nm diode laser, 488 nm DPSS laser, 640 nm diode laser | Andor | Confocal system | |
| Xylazine | Akorn | Anesthesia |
References
- Cheroutre, H., Lambolez, F., Mucida, D. The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 11 (7), 445-456 (2011).
- Hu, M. D., Edelblum, K. L. Sentinels at the frontline: the role of intraepithelial lymphocytes in inflammatory bowel disease. Current Pharmacology Reports. 3 (6), 321-334 (2017).
- Chen, Y., Chou, K., Fuchs, E., Havran, W. L., Boismenu, R. Protection of the intestinal mucosa by intraepithelial gamma delta T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (22), 14338-14343 (2002).
- Swamy, M., et al. Intestinal intraepithelial lymphocyte activation promotes innate antiviral resistance. Nature Communications. 6, 7090 (2015).
- Dalton, J. E., et al. Intraepithelial gammadelta+ lymphocytes maintain the integrity of intestinal epithelial tight junctions in response to infection. Gastroenterology. 131 (3), 818-829 (2006).
- Mombaerts, P., et al. Spontaneous development of inflammatory bowel disease in T cell receptor mutant mice. Cell. 75 (2), 274-282 (1993).
- Willcox, B. E., Willcox, C. R. gammadelta TCR ligands: the quest to solve a 500-million-year-old mystery. Nature Immunology. 20 (2), 121-128 (2019).
- Marchiando, A. M., et al. The epithelial barrier is maintained by in vivo tight junction expansion during pathologic intestinal epithelial shedding. Gastroenterology. 140 (4), e1201-e1202 (2011).
- Marchiando, A. M., et al. Caveolin-1-dependent occludin endocytosis is required for TNF-induced tight junction regulation in vivo. Journal of Cell Biology. 189 (1), 111-126 (2010).
- Yu, D., et al. MLCK-dependent exchange and actin binding region-dependent anchoring of ZO-1 regulate tight junction barrier function. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 107 (18), 8237-8241 (2010).
- Chieppa, M., Rescigno, M., Huang, A. Y., Germain, R. N. Dynamic imaging of dendritic cell extension into the small bowel lumen in response to epithelial cell TLR engagement. Journal of Experimental Medicine. 203 (13), 2841-2852 (2006).
- McDole, J. R., et al. Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine. Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).
- Edelblum, K. L., et al. Dynamic migration of gammadelta intraepithelial lymphocytes requires occludin. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (18), 7097-7102 (2012).
- Edelblum, K. L., et al. gammadelta Intraepithelial Lymphocyte Migration Limits Transepithelial Pathogen Invasion and Systemic Disease in Mice. Gastroenterology. 148 (7), 1417-1426 (2015).
- Hu, M. D., et al. Epithelial IL-15 Is a Critical Regulator of gammadelta Intraepithelial Lymphocyte Motility within the Intestinal Mucosa. Journal of Immunology. 201 (2), 747-756 (2018).
- Hoytema van Konijnenburg, D. P., et al. Intestinal Epithelial and Intraepithelial T Cell Crosstalk Mediates a Dynamic Response to Infection. Cell. 171 (4), 783-794 (2017).
- Prinz, I., et al. Visualization of the earliest steps of gammadelta T cell development in the adult thymus. Nature Immunology. 7 (9), 995-1003 (2006).
- Sandrock, I., et al. Genetic models reveal origin, persistence and non-redundant functions of IL-17-producing gammadelta T cells. Journal of Experimental Medicine. 215 (12), 3006-3018 (2018).
- Wang, X., Sumida, H., Cyster, J. G. GPR18 is required for a normal CD8alphaalpha intestinal intraepithelial lymphocyte compartment. Journal of Experimental Medicine. 211 (12), 2351-2359 (2014).
- Sumida, H., et al. GPR55 regulates intraepithelial lymphocyte migration dynamics and susceptibility to intestinal damage. Sci Immunol. 2 (18), (2017).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2 (2), (2011).
- Watson, A. J., et al. Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers. Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).
- Lodolce, J. P., et al. IL-15 receptor maintains lymphoid homeostasis by supporting lymphocyte homing and proliferation. Immunity. 9 (5), 669-676 (1998).
- Ma, L. J., Acero, L. F., Zal, T., Schluns, K. S. Trans-presentation of IL-15 by intestinal epithelial cells drives development of CD8alphaalpha IELs. Journal of Immunology. 183 (2), 1044-1054 (2009).
- Knoop, K. A., et al. Antibiotics promote the sampling of luminal antigens and bacteria via colonic goblet cell associated antigen passages. Gut Microbes. 8 (4), 400-411 (2017).
- Sujino, T., et al. Tissue adaptation of regulatory and intraepithelial CD4(+) T cells controls gut inflammation. Science. 352 (6293), 1581-1586 (2016).
- Zhang, B., et al. Differential Requirements of TCR Signaling in Homeostatic Maintenance and Function of Dendritic Epidermal T Cells. Journal of Immunology. 195 (9), 4282-4291 (2015).
- Chennupati, V., et al. Intra- and intercompartmental movement of gammadelta T cells: intestinal intraepithelial and peripheral gammadelta T cells represent exclusive nonoverlapping populations with distinct migration characteristics. Journal of Immunology. 185 (9), 5160-5168 (2010).
- Kolesnikov, M., Farache, J., Shakhar, G. Intravital two-photon imaging of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 421, 73-80 (2015).
