Aislamiento de fibroblastos para adultos primarios aumentados por ultrasonidos
Summary
Presentamos un protocolo para aislar los fibroblastos adultos primarios de una manera fácil, rápida y confiable, realizable por principiantes (por ejemplo, estudiantes). El procedimiento combina la digestión del tejido enzimático y la agitación mecánica con ondas ultrasónicas para obtener fibroblastos primarios. El protocolo se puede adaptar fácilmente a requisitos experimentales específicos (por ejemplo, tejido humano).
Abstract
Los fibroblastos adultos primarios se han convertido en una herramienta importante para estudiar la fibrosis, las interacciones con los fibroblastos y la inflamación en todos los tejidos del cuerpo. Dado que los fibroblastos primarios no pueden dividirse indefinidamente debido a la diferenciación de miofibroblastos o a la inducción de la senescencia, se deben establecer periódicamente nuevos cultivos. Sin embargo, hay varios obstáculos que superar durante los procesos de desarrollo de un protocolo de aislamiento fiable y el aislamiento primario de fibroblastos en sí: el grado de dificultad del método (especialmente para principiantes), el riesgo de contaminación bacteriana, el tiempo necesario hasta que los fibroblastos primarios se puedan utilizar para experimentos, y la posterior calidad celular y viabilidad. En este estudio, se proporciona un protocolo rápido, confiable y fácil de aprender para aislar y cultivar fibroblastos adultos primarios del corazón del ratón, pulmón, hígado y riñón combinando digestión enzimática y agitación ultrasónica.
Introduction
Los fibroblastos son células planas en forma de husillo con múltiplesprocesos estelares y un extenso retículo endoplasmático áspero 1,2. Un fibroblasto medio mide 30 – 100 m y tiene una vida útil de 57 a 3 días1,3. La duración media del ciclo celular de los fibroblastos humanos oscila entre 16 y 48 h dependiendo de las condiciones de cultivo4. Existe evidencia de que la capacidad replicativa y la calidad funcional de los fibroblastos primarios cultivados se correlacionan negativamente con la edad del donante, lo que sugiere que se debe preferir a los donantes más jóvenes (animales o pacientes) si es posible5,6 .
Los fibroblastos constituyen un tipo celular predominante de la mayoría de los tejidos corporales de mamíferos. A pesar de su presencia omnipresente, la identificaciónmolecular de los fibroblastos sigue siendo un desafío 7. Los fibroblastos migran a desarrollar tejidosy órganos de diferentes fuentes durante el desarrollo embrionario 8. Por esta razón, hay una plétora de proteínas marcadoras que se pueden encontrar en los fibroblastos, mientras que las proteínas marcadoras únicas, que están presentes en cada población de fibroblastos y exclusivas de los fibroblastos, todavía faltan. Por lo tanto, los patrones de expresión de varios marcadores reconocidos se utilizan generalmente para identificar fibroblastos. Entre los marcadores más reconocidos se encuentran la vimentina, la proteína superficial de fibroblastohumano humano (hFSP), el receptor de dominio de discoicina 2 (DDR2) y la actina muscular alfa suave (SMA).
Los fibroblastos son el tipo de célula que produce la matriz extracelular principal (ECM). De este tipo, los fibroblastos mantienen una arquitectura de tejido ordenada y proporcionan soporte mecánico para las células vecinas1. El equilibrio entre la síntesis y la degradación de ECM es un proceso bien regulado. Los cambios hacia la síntesis marcan el comienzo de una deposición excesiva de ECM que, si no se termina, conduce a la fibrosis. La fibrosis está mediada por miofibroblastos, que se originan a partir de fibroblastos activados sometidos a cambios moleculares y fenotípicos. Una característica distintiva de los miofibroblastos es la secreción mejorada de ECM y citoquinas y la expresión de microfilamentos ordenados de la ACM9.
Los fibroblastos primarios han estado en el centro de atención de investigaciones recientes centradas en la fibrosis, la inflamación de los tejidos y las interacciones fibroblastos-cáncer-células10,11. Sin embargo, para estudiar eficazmente las propiedades de los fibroblastos en la salud y la enfermedad, es necesario aislar los fibroblastos adultos primarios viables de forma regular. Existen varios métodos disponibles para aislar fibroblastos12,13,14. Los tres principales métodos de aislamiento de fibroblastos son el crecimiento de los trozos de tejido12,la digestión de tejido enzimático15,y la perfusión enzimática de órganos huecos9,13,16. La ventaja del crecimiento es un proceso de aislamiento suave sin degradación celular enzimática. Por otro lado, los cultivos de crecimiento generalmente requieren períodos de cultivo prolongados hasta que las células se pueden utilizar para experimentos. La digestión enzimática común es rápida, pero conlleva un riesgo de contaminación con otros tipos de células (por ejemplo, células endoteliales) o bacterias en el proceso de agitación, que es necesario para disolver mecánicamente el tejido. Además, estos métodos a menudo son elaborados y requieren tiempo y habilidad para aprender.
En cuanto a la importancia de los fibroblastos primarios en la investigación, todavía es necesario optimizar los enfoques de aislamiento celular existentes en términos de rapidez, simplicidad y fiabilidad. Aquí, se proporciona un nuevo método de aislamiento de fibroblastos enzimáticos a base de ultrasonidos que proporciona células de alta calidad.
Protocol
Representative Results
Discussion
En comparación con las líneas celulares de fibroblastos inmortalizadas, los fibroblastos primarios ofrecen varias ventajas. Pueden ser aislados de manera rentable en alta calidad y cantidad. Además, los cultivos primarios ofrecen la posibilidad de estudiar células de múltiples individuos, lo que aumenta la fiabilidad de los resultados obtenidos y disminuye la probabilidad de estudiar simplemente los artefactos de cultivo celular. La generación continua de nuevos cultivos primarios previene las alteraciones genétic…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a la Sra. Romy Kempe y a la Sra. Annett Opitz el apoyo técnico de expertos. También damos las gracias al Sr. Bjoern Binnewerg por el apoyo de TI. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de a) el Dresdedrner Herz-Kreislauf-Tage e.V., b) “Habilitationsf-rderprogramm f’r Frauen”, Facultad de Medicina Carl Gustav Carus Dresden y c) Else Kr’ner-Forschungskolleg (EKFK) Facultad de Medicina Carl Carus Dresden. Agradecemos la financiación y el apoyo.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | T4049-100ML | |
| Antibiotics | Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA | Gibco LS15140148 | Penicillin/ Streptomycin (10000 U/ml) |
| Cell culture hood | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 51023608 | HeraSafe KSP15 |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 50049176 | BBD 6220 |
| Cell culture plates | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | depends on vessel | 6-, 12-, 24-wells Nunclon surface |
| Cell culture suction | VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Germany | 20727400 | BVC professional suction |
| Cell strainer (mesh) | Corning, Tewksbury, USA | 431750 | 40 µm Nylon |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 75007213 | Megafuge 8R |
| Cordless pipetting controller | Hirschmann, Eberstadt, Germany | 9907200 | Pipetus |
| Disposable pipette tips | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | depends on volume | SafeSeal tips for pipettes (10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl) |
| Disposable plastic pipettes | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | depends on volume | 5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml |
| Disposable sterile scalpel | Myco Medical, Cary, USA | n.a. | Techno cut |
| Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 41965-062 | High glucose |
| Eppendorf tubes | Eppendorf, Hamburg, Germany | depends on volume | 50 µl, 500 µl, 1.500µl, 2.000 µl |
| Fetal calf serum (FCS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | F2442-50ML | |
| Collagenase blend | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 5401020001 | Liberase TL Research Grade |
| Petri dish 6 cm | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P5481-500EA | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D8537-500ML | 500 ml |
| Senescence detection kit | Abcam, Cambridge, UK | ab65351 | |
| Shaker/ Vortex | IKA, Staufen im Breisgau, Germany | n.a. | MS2 Minishaker (subsequent model: Ident-Nr.: 0020016017) |
| Sterile plastic tubes | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | Falcon 352095 | BD Falcon tubes (15 ml, 50 ml) |
| Ultrasonic water bath | BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin, Germany | 312 | Sonorex RK100H |
| Surgical scissors (atraumatic) | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | NR 82 | |
| Surgical scissors | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | eq 1060.09 | |
| Surgical forceps | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | BD577 |
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