成人小脳スライスにおける長期うつ病誘導の評価
Summary
一部の遺伝子操作動物では、単一のプロトコルを使用して、小脳プルキンジェ細胞にLTDを誘導できず、LTDと運動学習の間に不一致がある場合があります。遺伝子操作動物におけるLTD誘導を評価するには、複数のプロトコルが必要です。標準プロトコルが表示されます。
Abstract
シナプス可塑性は、学習と記憶のためのメカニズムを提供します。小脳運動学習では、並列繊維(PF)からプルキンジェ細胞(PC)へのシナプス伝達の長期うつ病(LTD)が運動学習の基礎と考えられており、LTDと運動学習の両方の欠陥が様々に観察されています。遺伝子操作された動物。運動運動反射(OKR)の適応、前庭眼反射(VOR)、ロタロッド試験などの一般的な運動学習セットを用いて、運動学習能力の評価に用いた。しかし、GluA2-カルボキシー終着を修飾したノックインマウスから得られた結果は、PF-LTDを欠いているにもかかわらず、VORおよびOKRの正常な適応を示した。その報告では、LTDの誘導は室温で1種類の刺激プロトコルを用いてのみ試みた。従って、小脳LTDを誘導する条件を、生理学的温度に近い時点で種々のプロトコルを用いて同じノックイン変異体で探索した。最後に、これらの遺伝子操作マウスにおいてLTDを誘導できる刺激プロトコルを見つけました。本研究では、LTD誘導を評価するための一連のプロトコルが提案され、LTDと運動学習との因果関係をより正確に調べることができます。結論として、遺伝子操作マウスにおいてLTDを評価する際には、実験条件が重要である。
Introduction
PC、分子層間ニューロン(バスケットおよび星状細胞)、ゴルジ細胞、顆粒細胞からのPF、苔状繊維およびクライミングファイバー(CF)で構成される小脳皮質の精巧な神経ネットワークのシナプス組織が解明された。励起/阻害と発散/収束の観点から、十分に組織化された回路図は、小脳が「ニューロンマシン」1であることを示唆しているが、この「機械」の目的については以前は考えられていなかった。その後、Marrは、PCへのPCへの入力がトリプル層連想学習ネットワーク2を構成することを提案しました。彼はまた、各CFが元素運動2のための脳の指示を伝えるように提案した。彼は、PFとCFの同時活性化がPF-PCシナプス活性を高め、PF-PCシナプスの長期増強(LTP)を引き起こすと仮定した。一方、アルバスは、PFとCFの同期活性化がPF-PCシナプス3でLTDをもたらしたと仮定した。上記の研究はいずれも、小脳をユニークな記憶装置と解釈し、その小脳皮質ネットワークへの組み込みは、マー・アルバスモデル学習機モデルの形成につながる。
これらの理論的予測に続いて、2行の証拠は、小脳中のシナプス可塑性の存在を示唆している。証拠の最初の行は、凝膜の解剖学的組織によって示唆されました。ここでは、前庭器官起源のMF経路と、頸部起源のCF経路がPC4に収束する。このユニークな収束パターンは、凝集体に発生するシナプス可塑性が前庭眼反射の顕著な適応性を引き起こすことを示唆している。第二に、フロクチュラスにおけるPC応答の記録および凝集の病変も上記仮説5、6、7を支持した。さらに、サルの手の動き8の適応中のPC放電パターンは、シナプス可塑性仮説、特にアルバスのLTD-仮説3を支持した。
シナプス可塑性の性質を直接決定するために、生体内でPCを特異的に刺激するPFの束とCFの繰り返し連結刺激(Cjs)は、PF-PCシナプス9の伝達有効性のためにLTDを誘導することが示された。 10、11.その後、小脳スライス12と培養PCを用いたインビトロ探査では、共培養顆粒細胞刺激とオリーブ細胞刺激13またはイオントフォレティック適用グルタメートと体性の組み合わせ脱分極14、15は株式会社を引き起こした。LTD-誘導の基礎となるシグナル伝達機構もインビトロ製剤16,17を用いて集中的に調べた。
前庭小脳皮質がVOR18の適応学習に不可欠な起源であることが証明されたため、VORおよびOKRの適応は、小脳運動学習に対する遺伝子操作効果の定量的評価にしばしば用いられた。,19,20 , OKR19,21 LTD誘導の失敗と行動運動学習の障害との相関関係は、LTDが運動において重要な役割を果たしていることを証明する証拠としてとなっている。学習メカニズム22.これらの見解は、総称して運動学習のLTD仮説、またはマーアルバスイトー仮説23、24、25、26と呼ばれる。
眼球運動の適応学習は同様のプロトコルを用いて測定され、一方、スライス調製27、28、29、30、31におけるLTDを誘導するために様々な実験条件が用いられた。.最近、Schonewille et al.26は、遺伝子操作されたマウスの一部が正常な運動学習を実証したが、小脳のスライスはLTDを示さなかったと報告し、それによってLTDは運動学習に不可欠ではないと結論付けた。しかし、LTDの誘導は室温で1種類のプロトコルを用いてのみ試みた。そこで、30°C前後の記録条件下でいくつかのタイプのLTD誘導プロトコルを用いて、これらのプロトコルを生理温度32に近い温度で用いることで、遺伝子操作マウスに確実に誘導されたことを確認した。
しかし、結膜刺激の基本的な特性に関するいくつかの疑問が残っています。1つ目は、複雑なスパイクの形状とLTDの振幅との関係です。第二に、PF刺激と体細胞脱分極と併せて、使用される刺激の数が必要か否かは解明されなかった。本研究では、これらの質問を野生型(WT)マウスを用いて検討した。
Protocol
Representative Results
Discussion
4つのプロトコル間の違い
LTD誘導プロトコル1および2において、Cjs 300回を1Hzで誘導するのに十分であり、CFの刺激頻度は生理学的範囲にあるように見えたが、アラート成人マウスにおける複雑なスパイク発射速度(P60)は1.25Hz36であることが報告された。しかしながら、CF刺激だけではPF-CFシナプスにおいて長期可塑性を引き起こさなかったが、プロトコル1お?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、A.オバの技術援助に感謝します。この研究は、科学研究のための助成金(C)17K01982からK.Y.に部分的に支援されました。
Materials
| Amplifier | Molecular Devices-Axon | Multiclamp 700B | |
| Borosilicate glass capillary | Sutter | BF150-110-10 | |
| Digitizer | Molecular Devices-Axon | Digidata1322A | |
| Electrode puller | Sutter | Model P-97 | |
| Isoflurane | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 26675-46-7 | |
| Isolator | A.M.P.I. | ISOflex | |
| Linear slicer | Dosaka EM | PRO7N | |
| Microscope | NIKON | Eclipse E600FN | |
| Peristaltic pump | Gilson | MP1 Single Channel Pump | |
| Picrotoxin | Sigma-Aldrich | P1675 | |
| Pure water maker | Merck-Millipore | MilliQ 7000 | |
| Software for experiment | Molecular probe-Axon | pClamp 10 | |
| Software for statistics | KyensLab | KyPlot 5.0 | |
| Stimulator | WPI | DS8000 | |
| Temperature controller | Warner | TC-324B | |
| Tetrodotoxin | Tocris | 1078 |
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