Avaliação da indução de depressão em longo prazo em fatias Cerebelares adultas
Summary
Em alguns animais gene-manipulados, usar um único protocolo pode não induzir o LTD em pilhas Cerebelares de Purkinje, e pode haver uma discrepância entre o LTD e a aprendizagem do motor. Os protocolos múltiplos são necessários avaliar a LTD-indução em animais gene-manipulados. Os protocolos padrão são mostrados.
Abstract
A plasticidade sináptica fornece um mecanismo de aprendizado e memória. Para a aprendizagem do motor cerebelar, a depressão a longo prazo (Ltd) de transmissões sináptica das fibras paralelas (PF) às pilhas de Purkinje (PC) é considerada a base para a aprendizagem do motor, e as deficiências do Ltd e da aprendizagem do motor são observadas em vários animais manipulados por genes. Conjuntos de aprendizagem motora comum, como a adaptação do reflexo optocinético (okr), o reflexo vestibular-ocular (VOR) e o teste de do foram utilizados para avaliação da capacidade de aprendizagem motora. Entretanto, os resultados obtidos dos camundongos Knock-in modificados no término do GluA2-carboxy demonstraram a adaptação normal do VOR e do OKR, apesar da falta de PF-LTD. Nesse relatório, a indução do LTD foi tentada somente usando um tipo de protocolo da estimulação na temperatura ambiente. Assim, as condições para induzir o LTD cerebelar foram exploradas nos mesmos mutantes do Knock-in que usam vários protocolos na temperatura fisiológica próxima. Finalmente, nós encontramos protocolos da estimulação, por que LTD poderia ser induzida nestes ratos gene-manipulados. Neste estudo, um conjunto de protocolos é proposto para avaliar a indução de LTD, o que permitirá um exame mais preciso da relação causal entre o LTD e a aprendizagem motora. Em conclusão, as condições experimentais são cruciais na avaliação de LTD em camundongos manipulados por genes.
Introduction
A organização sináptica das redes neuronais elaboradas do córtex cerebelar, composta por PCs, interneurônios de camada molecular (cesta e células esteladas), células de Golgi, PFs de células de grânulos, fibras Mossy e fibras de escalada (CFs), foram elucidados em termos de excitação/inibição e divergência/convergência, e o diagrama de circuitos bem organizados sugeriu que o cerebelo é uma “máquina neuronal”1, embora não houvesse anteriormente nenhuma idéia sobre a finalidade desta “máquina”. Posteriormente, a Marr propôs que a entrada de PFs em PCs constitua uma rede de aprendizagem associativa de camada tripla2. Ele também sugeriu que cada CF transmite uma instrução cerebral para o movimento elementar2. Ele assumiu que a ativação simultânea de PFs e CF melhoraria a atividade da sinapse PF-PC, e causava potenciação a longo prazo (LTP) da sinapse PF-PC. Por outro lado, a Albus assumiu que a ativação síncrona de PFs e CF resultou em LTD nas sinapses PF-PC3. Ambos os estudos acima interpretam o cerebelo como um dispositivo original da memória, a incorporação de que na rede cortical cerebelar conduz à formação do modelo da máquina da aprendizagem do modelo de Marr-Albus.
Seguindo estas predições teóricas, duas linhas de evidência sugerem a presença de plasticidade sináptica no cerebelo. A primeira linha de evidência foi sugerida pela organização anatômica do floculus; aqui as vias MF de origem de órgãos vestibulares e vias CF de origem retiniana convergem nos PCs4. Este teste padrão original da convergência sugere que uma plasticidade sináptica que ocorre no flocculus cause a adaptação notável do reflexo vestíbulo-ocular. Segundo, a gravação da resposta dos PCs no floculado e o lesioning do floculus também apoiaram a hipótese acima de5,6,7. Além disso, o padrão de descarga do PC durante a adaptação do movimento da mão de um macaco8 apoiou a hipótese da plasticidade sináptica, especialmente a hipótese de Albus Ltd-3.
Para determinar a natureza da plasticidade sináptica diretamente, a estimulação conjuntivo repetida (CJS) de um pacote de PFS e o CF que inervam especificamente o PC in vivo foi mostrado para induzir o Ltd para a eficácia da transmissão do PF-PC sinapses9, 10,11. Nas explorações subseqüentes in vitro usando uma fatia cerebelar12 e PCes cultivados, a conjunção da estimulação cocultivada da pilha do grânulo e da estimulação da pilha verde-oliva13 ou a conjunção do glutamato após aplicado e somático despolarização14,15causou Ltd . O mecanismo de transdução de sinal subjacente à indução Ltd também foi intensivamente investigado por meio de preparações in vitro16,17.
As adaptações do VOR e do OKR foram usadas frequentemente para a avaliação quantitativa de efeitos da gene-manipulação na aprendizagem do motor cerebelar, porque o córtice vestibule-cerebelar foi provado ser a origem essencial na aprendizagem adaptativa do VOR18 ,19,20 e o okr19,21 a correlação entre a falha da indução do Ltd e o prejuízo da aprendizagem motora comportamental foi tomada como a evidência que Ltd desempenha um papel essencial no motor mecanismos de aprendizagem22. Essas visões são coletivamente referidas como a hipótese de Ltd de aprendizagem motora, ou hipótese de Marr-Albus-Ito23,24,25,26.
A aprendizagem adaptativa do movimento ocular foi mensurada por protocolos semelhantes, enquanto várias condições experimentais foram utilizadas para induzir o Ltd na preparação da fatia27,28,29,30,31 . Recentemente, Schonewille et al.26 relataram que alguns camundongos manipulados por genes demonstraram aprendizagem motora normal, mas as fatias Cerebelares não mostraram o Ltd e, assim, concluíram que a Ltd não era essencial para a aprendizagem motora. Entretanto, a indução de LTD foi tentada somente usando um tipo de protocolo na temperatura ambiente. Daqui, nós usamos diversos tipos de protocolos LTD-induzindo condições da gravação em torno de 30 ° c, e nós confirmamos que o LTD estêve induzido confiantemente nos ratos gene-manipulados usando estes protocolos em temperaturas physiological próximas32.
No entanto, permanecem algumas questões sobre as propriedades básicas da estimulação conjuntiva. O primeiro é a relação entre a forma do pico complexo e a amplitude de LTD. Em segundo lugar, em conjunto com a PF-estimulação e a despolarização somática, se o número de estímulos utilizados era necessário ou não era elusivo. No presente estudo, essas questões foram investigadas com camundongos tipo Wild (WT).
Protocol
Representative Results
Discussion
Diferenças entre os quatro protocolos
Nos protocolos de indução de LTD 1 e 2, CJS 300 vezes em 1 Hz é suficiente para induzir cerebelar LTD. a frequência de estimulação da FC pareceu estar em uma faixa fisiológica, pois a taxa de queima de espiga complexa em camundongos adultos alertas (“”) foi relatada como sendo 1,25 Hz36. No entanto, a estimulação da FC isoladamente não ocasionou a plasticidade a longo prazo na sinapse PF-CF, conforme utilizado nos protocolo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos A A. Oba por sua assistência técnica. Esta pesquisa foi parcialmente apoiada por Grant-in-Aid para pesquisa científica (C) 17K01982 para KY
Materials
| Amplifier | Molecular Devices-Axon | Multiclamp 700B | |
| Borosilicate glass capillary | Sutter | BF150-110-10 | |
| Digitizer | Molecular Devices-Axon | Digidata1322A | |
| Electrode puller | Sutter | Model P-97 | |
| Isoflurane | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 26675-46-7 | |
| Isolator | A.M.P.I. | ISOflex | |
| Linear slicer | Dosaka EM | PRO7N | |
| Microscope | NIKON | Eclipse E600FN | |
| Peristaltic pump | Gilson | MP1 Single Channel Pump | |
| Picrotoxin | Sigma-Aldrich | P1675 | |
| Pure water maker | Merck-Millipore | MilliQ 7000 | |
| Software for experiment | Molecular probe-Axon | pClamp 10 | |
| Software for statistics | KyensLab | KyPlot 5.0 | |
| Stimulator | WPI | DS8000 | |
| Temperature controller | Warner | TC-324B | |
| Tetrodotoxin | Tocris | 1078 |
References
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