Denne artikel forklarer i detaljer en systematisk tilgang til vurdering af mikromineraltilgængelighed hos atlanterhavslaks. Metoden omfatter værktøjer og modeller med stigende biologisk kompleksitet: (1) kemisk spektringsanalyse, (2) in vitro-opløselighed, (3) optagelsesundersøgelser i cellelinjer og (4) in vivofiskeundersøgelser.
Vurdering af tilgængeligheden af mikromineraler i kosten er en stor udfordring i mineralernæring af fiskearter. Formålet med denne artikel er at beskrive en systematisk tilgang, der kombinerer forskellige metoder til vurdering af tilgængeligheden af zink (Zn) i atlanterhavslaks (Salmo salar). I betragtning af at flere Zn kemiske arter kan være til stede i et atlanterhavslaksfoder, blev det antaget, at Zn-tilgængelighed påvirkes af Zn-kemiske arter, der er til stede i foderet. I denne undersøgelse handler den første protokol således om, hvordan man udvinder de forskellige Zn-kemiske arter fra foderet og analyserer dem ved hjælp af en størrelsesudelukkelseskromatografi-induktivt koblet plasmamassespektroskopi (SEC-ICP-MS) metode. Efterfølgende blev der udviklet en in vitro-metode til at evaluere opløseligheden af kosten Zn i atlanterhavslaksfoder. Den tredje protokol beskriver metoden til at undersøge virkningen af at ændre Zn kemiske arter sammensætning på optagelsen af Zn i en fisk intestinal epitel model ved hjælp af en regnbueørred tarm celle linje (RTgutGC). Tilsammen blev resultaterne fra in vitro-metoderne sammenlignet med en in vivo-undersøgelse, der undersøgte den tilsyneladende tilgængelighed af uorganiske og organiske kilder til Zn suppleret med atlanterhavslaksfoder. Resultaterne viste, at flere Zn kemiske arter kan findes i feeds og effektiviteten af en organisk Zn kilde afhænger meget af aminosyren ligand bruges til at chelate Zn. Resultaterne af in vitro-metoderne havde mindre korrelation med dette resultat af in vivo-undersøgelsen. Ikke desto mindre gav in vitro-protokoller, der er beskrevet i denne artikel, vigtige oplysninger om Zn-tilgængelighed og dens vurdering i fiskefoder.
Fiskemel og fiskeolie blev traditionelt brugt i atlanterhavslaksfoder. Disse ingredienser erstattes dog i stigende grad af plantebaserede ingredienser1. Ovennævnte skift i fodersammensætningen har resulteret i lav tilgængelighed i kosten og et øget behov for at forbedre mineraltilgængeligheden i atlanterhavslaksfoder, især zink (Zn)2. Den reducerede tilgængelighed kan være et resultat af en ændring i Zn-niveauet, Zn kemiske arter eller / og antinutritional faktorer til stede i foder matrix. I dette scenario er der opstået en ny række tilsætningsstoffer, der generisk betragtes som “organiske kilder”, med potentiale til at være en bedre tilgængelig kilde til kostmineraler til fisk. Derfor er det vigtigt at forstå grundlæggende kemi og fysiologi, der styrer tilgængeligheden af mineraler og deres kilder til fisk. Zink er et vigtigt sporstof for alle levende organismer3. Zn’s rolle som signalmolekyle er blevet beskrevet på både det paracellulære og intracellulære niveau i fisk4. Hos atlanterhavslaks har Zn-mangel været forbundet med skeletabnormaliteter og reduceret aktivitet af forskellige Zn metalloenzymer5,6.
Denne undersøgelse beskriver en systematisk tilgang til at forstå Zn tilgængelighed ved at kategorisere det i fire forskellige rum af varieret kemisk og biologisk kompleksitet. De anvendte metoder er beskrevet i fire afsnit, som det fremgår af figur 1: 1) vurdering af Zn-kemiske arter i den opløselige del af et atlanterhavslaksfoder ved hjælp af en størrelsesekskludografi-induktivt koblet plasmamassespektroskopi (SEC-ICP-MS) metode7; 2) in vitro-opløselighed af suppleret Zn i atlanterhavslaksfoder 3) vurdering af Zn-kemiske arters anvendelse ved in vitro intestinal model (RTgutGC)8 og (4) tilsyneladende tilgængelighed af Zn i atlanterhavslaks(Salmo salar)9. Lignende protokoller kan udvikles for andre mineraler (f.eks. mangan, selen, kobber) af ernæringsmæssig interesse for akvakulturfiskearter.
Tarmabsorptionen af Zn synes at være påvirket af den kemiske form af Zn-arterne13. I den forbindelse gjorde anvendelsen af de protokoller, der er beskrevet i denne artikel, det muligt sekventielt at undersøge de kemiske og biologiske aspekter, der ligger til grund for »tilgængeligheden« af Zn i atlanterhavslaks.
Denne undersøgelse rapporterede brugen af en Zn speciation analysemetode. SEC-ICP-MS-metoden fremlagde kvalitative data om den kemiske arts molekylvægt, der findes i den opløselige del af et atlanterhavslaksfoder. Dette blev opnået ved at sammenligne retentionstiderne for molekylvægtkalibreringsstandarderne (dvs. thyroglobulin (660 kDa), Zn/Cu superoxidformutase (32 kDa), myoglobin (17 kDa) og vitamin B12 (1,36 kDa)) med retentionstiderne for Zn indeholdende toppe. En udfordring, der blev fundet i Zn-speciationanalysen, var identifikationen af de ukendte Zn-kemiske arter på grund af manglende analytiske standarder. I SEC er adskillelsen af molekylerne baseret på deres størrelser i forhold til porerne i den stationære fase. I princippet vil større molekyler rejse hurtigere, eluting først, og mindre molekyler vil rejse langsommere, eluting senere14. Derfor kan hver Zn indeholdende top indeholde flere forbindelser med lignende molekylvægt15. Dette bidrager også til udfordringen med at identificere ukendte Zn kemiske arter. Desuden blev flere milde ekstraktionsbetingelser testet for udvinding af Zn. Den udvundne Zn var lav (~ 10%). Milde ekstraktionsbetingelser blev anvendt for at holde Zn kemiske arter intakte, men dette kan have kompromitteret ekstraktionseffektiviteten7.
I in vitro-opløselighedsanalysen indikerede opløseligheden af suppleret Zn (som radioisotop 65ZnCl2),at aminosyrerne, især histidin og lysin, øgede opløseligheden af Zn (Figur 5). Brug af foderprøver direkte til in vitro-opløselighedsanalyser under simulerede gastrointestinale tilstande er baseret på viden om, at ændringer i Zn-speciation er pH-afhængige16. Sure forhold i begyndelsen af mave- og tv-traktaten kan dog resultere i en vis ændring i speciationen, som kan være uigenkaldelig (f.eks. ZnO -> ZnCl2, i nærværelse af HCl under sure forhold i maven). Ikke desto mindre er den Zn-kilde, der anvendes her, ZnSO4, og hvis opløselighed blev forbedret af aminosyrer i mediet. Det næste spørgsmål, der skal besvares, var: Kan den øgede opløselighed oversættes til tilgængelighed? RTgutGC intestinal celle linje blev brugt til at studere dette spørgsmål. I forbindelse med mineralernæring hos dyr er udtrykket »tilgængelighed« svært at definere og kan reguleres forskelligt i cellerne (in vitro) sammenlignet med et dyr (in vivo). Derfor blev udtrykket “optagelse” brugt, når det kom til in vitro-evalueringen ved hjælp af tarmcellelinjen. Cellelinjen gav nyttige oplysninger om Zn-optagelsesmekanismerne ved tarmepilet, som er en del af den komplekse lovgivningsproces, der regulerer mineraltilgængelighed hos dyr. RTgutGC-cellerne fremkaldte en bedre kapacitet til apikal optagelse af Zn i nærværelse af en aminosyre (dvs. methionin; Figur 6). Den tilsyneladende tilgængelighed i vivo var imidlertid ikke signifikant forskellig mellem uorganiske og økologiske Zn-kilder i atlanterhavslaks. I in vivo-tilgængelighedsundersøgelsen blev Zn-kildesammenligningen foretaget ved Zn-niveauer i kosten, der var langt over de kendte Zn-krav hos atlanterhavslaks17, i alt Zn-koncentrationen på 150 mg/kg foder. Forskellene i tilgængelighed visualiseres bedre, når de testede kostniveauer falder i det lineære dynamikområde, før dyret når mætning. I denne in vivo-undersøgelse er det muligt, at atlanterhavslaksen var godt mættet til observeret forskel i Zn absorption mellem anvendte kilder.
Sammenfattende gav den første metode kvalitative oplysninger om forskellige Zn-kemiske arter, der findes i den opløselige del af et atlanterhavslaksfoder. den anden metode, in vitro opløselighed af suppleret Zn blev forbedret i nærværelse af aminosyre ligands; den tredje metode bekræftede, at forbedret opløselighed ved aminosyrer kan forbedre optagelsen ved tarmepitele omvendt lykkedes det ikke den fjerde metode at finde forskelle i tilgængeligheden af Zn fra uorganisk eller organisk kilde til atlanterhavslaks. Afslutningsvis, men ikke i overensstemmelse med in vivo resultater, in vitro protokoller gav interessant indsigt i at forstå de forskellige komponenter i Zn tilgængelighed.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev udført under projektet APREMIA (Tilsyneladende tilgængelighed og krav om mineraler i atlanterhavslaks, tilskud nr. 244490) finansieret af det norske forskningsråd.
0.45 µm syringe filter | Sartorius | ||
0.45 μm membrane filter | Pall | ||
10 % fetal bovine serum | Eurobio | ||
1282 Compugamma Laboratory Gamma Counter | LKB Wallac | ||
24 well plates (Falcon, TPP microplates) | Thermo Fisher Scientific | 10048760 | |
2-aminobicyclo(2.2.1)heptane-2-carboxylic acid | Sigma Aldrich | A7902 | |
75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks) | TPP Techno Plastic Products AG | 90075 | |
L-Arginine | Sigma Aldrich | A5006 | |
Bradford assay kit | Bio-Rad | 5000001 | |
Centrifuge | Eppendorf Centrifuge 5702 | ||
L-Cysteine | Sigma Aldrich | 30089 | |
DL-methionine | Alfa Aesar | 59-51-8 | |
D-methionine | Sigma Aldrich | M9375 | |
Experimental fish feeds | Skretting | ||
Glycine | Sigma Aldrich | 410225 | |
Guard column, TSKgel SWxl Type (7 μm particle size) | Tosoh | ||
L-Histidine | Sigma Aldrich | 53319 | |
HPLC coupled with a 7500ce ICP-MS | Agilent Technologies | ||
Hydrochloric acid | Emsure ACS, ISO, 37% w/w, Merck | 1.00317 | |
Knife mill | GM 300, Retsch Gmbh | ||
L-15 medium | Invitrogen/Gibco | 21083027 | |
L-methionine | Sigma Aldrich | M9625 | |
L-Lysine | Sigma Aldrich | 23128 | |
Methanol | LiChrosolv, HPLC grade, Merck | 1.06035 | |
Milli-Q water (18.2 MΩ cm) | EMD Millipore Corporation | ||
Myoglobin | Sigma Aldrich | M1882 | |
NexION 350D ICP-MS | Perkin Elmer | ||
Pasteur pipette | VWR | ||
pH meter | inoLab | ||
Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | 806552 | |
RTgutGC cells | Obtained in kind from Professor Dr. Kristin Schirmer, Dept. of Environmental Toxicology, Eawag, Swiss Federal Institute of Aquatic Science and Technology, Switzerland | ||
SEC column, TSKgel G3000SWxl | Tosoh | ||
Sieve stainless steel (850 μm – 1.12 mm) | Retsch | ||
Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma Aldrich | 436143 | |
Superoxide dismutase | Sigma Aldrich | S7571 | |
Thyroglobulin | Sigma Aldrich | T1001 | |
Tricaine methanesulphonate | PharmaQ | ||
Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma Aldrich | 252859 | |
Trypsin in 0.25% in phosphate-buffer saline | Biowest | L0910 | |
Versene EDTA solution | Invitrogen/Gibco | 15040-033 | |
Vitamin B12 | Sigma Aldrich | V2876 | |
Zinc chelate of glycine | Phytobiotics | ||
Zinc sulphate | Vilomix |