Enkelcellig RNA-sekvensering och analys av humana Pankreasöar
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att generera högkvalitativa, storskaliga transkriptome data av enskilda celler från isolerade mänskliga pankreasöar med hjälp av en droplet-baserade mikrofluidic Single-cell RNA sekvensering teknik.
Abstract
Pankreasöar består av endokrina celler med distinkta hormon uttrycksmönster. De endokrina cellerna uppvisar funktionella skillnader som svar på normala och patologiska tillstånd. Målet med detta protokoll är att generera högkvalitativa, storskaliga transkriptome data av varje endokrin celltyp med hjälp av en droplet-baserade mikroflödessystem Single-cell RNA sekvensering teknik. Sådana data kan utnyttjas för att bygga gen uttrycks profil av varje endokrin celltyp i normala eller specifika förhållanden. Processen kräver noggrann hantering, noggrann mätning och noggrann kvalitetskontroll. I detta protokoll beskriver vi detaljerade steg för mänskliga pankreasöar dissociation, sekvensering och dataanalys. De representativa resultaten av cirka 20 000 humana singelcellöar visar att protokollet har genomförts framgångsrikt.
Introduction
Pankreasöar släppa endokrina hormoner för att reglera blodsockernivåerna. Fem endokrina celltyper, som skiljer sig funktionellt och morfologiskt, är involverade i denna viktiga roll: α-celler producerar glukagon, β-cells insulin, δ-cells somatostatin, PP-celler pankreaspolypeptid och ε-celler ghrelin1. Profilering av genuttryck är en användbar metod för att karakterisera de endokrina cellerna under normala eller specifika förhållanden. Historiskt sett har hela Holmen gen uttrycks profilering genererats med hjälp av microarray och Next-generation RNA-sekvensering2,3,4,5,6,7 , 8. även om hela Holmen transkriptome är informativ för att identifiera organspecifika utskrifter och sjukdomar kandidat gener, det misslyckas med att avslöja molekyl heterogenitet av varje ö-celltyp. Laser Capture microdissection (LCM) teknik har tillämpats för att direkt erhålla specifika celltyper från öar9,10,11,12 men inte är av renhet av den riktade cellen Befolkningen. För att övervinna dessa begränsningar har fluorescensaktiverad cell sortering (FACS) använts för att välja specifika endokrina cellpopulationer, såsom α-och β-celler13,14,15,16 , 17 , 18. Dessutom använde dorrell et al. en antikroppsbaserad FACS sortering metod för att klassificera β-celler i fyra subpopulationer19. FACS-sorterade ö-celler kan också pläteras för RNA-sekvensering av enstaka celler; dock ställs plattbaserade metoder inför utmaningar i skalbarheten20,21,22.
För att generera hög kvalitet, storskaliga transkriptome data av varje endokrin celltyp, tillämpade vi mikroflödessystem teknik för att mänskliga ö-celler. Den mikroflödessystem plattformen genererar transkriptome data från ett stort antal enskilda celler i ett högt dataflöde, hög kvalitet, och skalbara sätt23,24,25,26,27. Förutom att avslöja molekylära egenskaper hos en celltyp som fångas i en stor mängd, möjliggör mycket skalbar mikroflödessystem-plattform identifiering av sällsynta celltyper när tillräckligt många celler tillhandahålls. Därför, tillämpning av plattformen till mänskliga pankreasöar tillät profilering av ghrelin-utsöndra ε-celler, en sällsynt endokrin celltyp med föga känd funktion på grund av dess brist28. Under de senaste åren har flera studier publicerats av oss och andra som rapporterar storskaliga transkriptomdata från humana öar med hjälp av tekniken29,30,31,32, 33. Uppgifterna är allmänt tillgängliga och användbara resurser för Holmen samfundet att studera endokrina cellers heterogenitet och dess konsekvenser för sjukdomar.
Här beskriver vi en droplet-baserade mikroflödessystem Single-cell RNA sekvenserings protokoll, som har använts för att producera transkriptome data av cirka 20 000 mänskliga öar celler inklusive α-, β-, δ-, PP, ε-celler, och en mindre andel av icke-endokrina celler 32. arbetsflödet börjar med isolerade mänskliga öar och skildrar steg av holme cell dissociation, Single-cell Capture, och dataanalys. Protokollet kräver användning av nyligen isolerade öar och kan tillämpas på öar från människor och andra arter, såsom gnagare. Använda detta arbetsflöde, opartisk och omfattande Holmen cell Atlas under baslinjen och andra villkor kan byggas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Single-cell-teknik som utvecklats under de senaste åren ger en ny plattform för att karakterisera celltyper och studera molekylära heterogenitet i mänskliga pankreasöar. Vi antog ett protokoll av droplet-baserade mikroflödessystem Single-cell isolering och dataanalys för att studera mänskliga öar. Vårt protokoll producerade framgångsrikt RNA-sekvenserings data från över 20 000 enstaka humana ö-celler med relativt små variationer i sekvenskvalitet och batcheffekter.
I synnerhet ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ingen
Materials
| 30 µm Pre-Separation Filters | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | Cell strainer |
| 8-chamber slides | Chemometec | 102673-680 | Dell counting assay slides |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | for QC |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | Single cell media |
| Chromium Single Cell 3' Library & Gel Bead Kit v2, 16 rxns | 10X Genomics | 120237 | Single cell reagents |
| Chromium Single Cell A Chip Kit v2, 48 rx (6 chips) | 10X Genomics | 120236 | Microfluidic chips |
| CMRL-1066 | ThermoFisher | 11530-037 | Complete islet media |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | Elution buffer |
| Eppendorf twin-tec PCR plate, 96-well, blue, semi-skirted | VWR | 47744-112 | Emulsion plate |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000-036 | Complete islet media |
| Human islets | Prodo Labs | HIR | Isolated human islets |
| L-Glutamine (200 mM) | ThermoFisher | 25030-081 | Complete islet media |
| Nextera DNA Library Preparation Kit (96 samples) | Illumina | FC-121-1031 | Library preparation reagents |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 cycles) | Illumina | FC-404-2005 | Sequencing |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140-122 | Complete islet media |
| Qubit High Sensitivity dsDNA Kit | Life Technologies | Q32854 | for QC |
| Solution 18 | Chemometec | 103011-420 | Cell counting assay reagent |
| SPRISelect Reagent | Fisher Scientific | B23318 | Purification beads |
| Tissue Culture Dishes (10 cm) | VWR | 10861-594 | for islet culture |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | Cell dissociation solution |
| Zymo DNA Clean & Concentrator-5, 50 reactions | VWR | 77001-152 | Library clean up columns |
References
- Gutierrez, G. D., Gromada, J., Sussel, L. Heterogeneity of the Pancreatic Beta Cell. Frontiers in Genetics. 8 (22), (2017).
- Eizirik, D. L., et al. The human pancreatic islet transcriptome: expression of candidate genes for type 1 diabetes and the impact of pro-inflammatory cytokines. PLoS Genetics. 8 (3), e1002552 (2012).
- Fadista, J., et al. Global genomic and transcriptomic analysis of human pancreatic islets reveals novel genes influencing glucose metabolism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (38), 13924-13929 (2014).
- Gunton, J. E., et al. Loss of ARNT/HIF1beta mediates altered gene expression and pancreatic-islet dysfunction in human type 2 diabetes. Cell. 122 (3), 337-349 (2005).
- Kutlu, B., et al. Detailed transcriptome atlas of the pancreatic beta cell. BMC Medical Genomics. 2 (3), (2009).
- Maffei, A., et al. Identification of tissue-restricted transcripts in human islets. Endocrinology. 145 (10), 4513-4521 (2004).
- Moran, I., et al. Human beta cell transcriptome analysis uncovers lncRNAs that are tissue-specific, dynamically regulated, and abnormally expressed in type 2 diabetes. Cell Metabolism. 16 (4), 435-448 (2012).
- van de Bunt, M., et al. Transcript Expression Data from Human Islets Links Regulatory Signals from Genome-Wide Association Studies for Type 2 Diabetes and Glycemic Traits to Their Downstream Effectors. PLoS Genetics. 11 (12), e1005694 (2015).
- Ebrahimi, A., et al. Evidence of stress in beta cells obtained with laser capture microdissection from pancreases of brain dead donors. Islets. 9 (2), 19-29 (2017).
- Marselli, L., Sgroi, D. C., Bonner-Weir, S., Weir, G. C. Laser capture microdissection of human pancreatic beta-cells and RNA preparation for gene expression profiling. Methods in Molecular Biology. 560, 87-98 (2009).
- Marselli, L., et al. Gene expression profiles of Beta-cell enriched tissue obtained by laser capture microdissection from subjects with type 2 diabetes. PLoS One. 5 (7), e11499 (2010).
- Sturm, D., et al. Improved protocol for laser microdissection of human pancreatic islets from surgical specimens. Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).
- Ackermann, A. M., Wang, Z., Schug, J., Naji, A., Kaestner, K. H. Integration of ATAC-seq and RNA-seq identifies human alpha cell and beta cell signature genes. Molecular Metabolism. 5 (3), 233-244 (2016).
- Benner, C., et al. The transcriptional landscape of mouse beta cells compared to human beta cells reveals notable species differences in long non-coding RNA and protein-coding gene expression. BMC Genomics. 15 (620), (2014).
- Blodgett, D. M., et al. Novel Observations From Next-Generation RNA Sequencing of Highly Purified Human Adult and Fetal Islet Cell Subsets. Diabetes. 64 (9), 3172-3181 (2015).
- Bramswig, N. C., et al. Epigenomic plasticity enables human pancreatic alpha to beta cell reprogramming. The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1275-1284 (2013).
- Dorrell, C., et al. Transcriptomes of the major human pancreatic cell types. Diabetologia. 54 (11), 2832-2844 (2011).
- Nica, A. C., et al. Cell-type, allelic, and genetic signatures in the human pancreatic beta cell transcriptome. Genome Research. 23 (9), 1554-1562 (2013).
- Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of beta cells. Nature Communications. 7, 11756 (2016).
- Li, J., et al. Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types. EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).
- Muraro, M. J., et al. A Single-Cell Transcriptome Atlas of the Human Pancreas. Cell Systems. 3 (4), 385-394 (2016).
- Segerstolpe, A., et al. Single-Cell Transcriptome Profiling of Human Pancreatic Islets in Health and Type 2 Diabetes. Cell Metabolism. 24 (4), 593-607 (2016).
- Bose, S., et al. Scalable microfluidics for single-cell RNA printing and sequencing. Genome Biology. 16 (120), (2015).
- Fan, H. C., Fu, G. K., Fodor, S. P. Expression profiling. Combinatorial labeling of single cells for gene expression cytometry. Science. 347 (6222), 1258367 (2015).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Zheng, G. X., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8 (14049), (2017).
- Dominguez Gutierrez, G., et al. Signature of the Human Pancreatic epsilon Cell. Endocrinology. 159 (12), 4023-4032 (2018).
- Baron, M., et al. A Single-Cell Transcriptomic Map of the Human and Mouse. Pancreas Reveals Inter- and Intra-cell Population Structure. Cell Systems. 3 (4), 346-360 (2016).
- Lawlor, N., et al. Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type-specific expression changes in type 2 diabetes. Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).
- Wang, Y. J., et al. Single-Cell Transcriptomics of the Human Endocrine Pancreas. Diabetes. 65 (10), 3028-3038 (2016).
- Xin, Y., et al. Pseudotime Ordering of Single Human beta-Cells Reveals States of Insulin Production and Unfolded Protein Response. Diabetes. 67 (9), 1783-1794 (2018).
- Xin, Y., et al. RNA Sequencing of Single Human Islet Cells Reveals Type 2 Diabetes Genes. Cell Metabolism. 24 (4), 608-615 (2016).
- Chemometec. . Nucleocounter NC-250: Cell count and viability assay. , (2015).
- 10X Genomics. . 10X Genomics: Chromium Single Cell 3’ Reagents Kits v2: User Guide. , (2017).
- Agilent Technologies. . Agilent Bioanalyzer: High Sensitivity DNA Kit Guide. , (2013).
- Thermo Fischer Scientific. . Qubit: dsDNA High Sensitivity Assay Kit. , (2015).
- Illumina. . Illumina Nextera DNA Library Prep Reference Guide. , (2016).
- Illumina. . llumina NextSeq 500 System Guide. , (2018).
- Scrucca, L., Fop, M., Murphy, T. B., Raftery, A. E. mclust 5: Clustering, Classification and Density Estimation Using Gaussian Finite Mixture Models. R J. 8 (1), 289-317 (2016).
- Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36 (5), 411-420 (2018).
- Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single cell data. Preprint at bioRixv. , (2018).
- DePasquale, E. A. K., et al. DoubletDecon: Cell-State Aware Removal of Single-Cell RNA-Seq Doublets. bioRxiv. , (2018).
- McGinnis, C. S., Murrow, L. M., Gartner, Z. J. DoubletFinder: Doublet detection in single-cell RNA sequencing data using artificial nearest neighbors. bioRxiv. , (2018).
- Wolock, S. L., Lopez, R., Klein, A. M. Scrublet: computational identification of cell doublets in single-cell transcriptomic data. bioRxiv. , (2018).
- Dominguez Gutierrez, G., et al. Gene Signature of Proliferating Human Pancreatic alpha Cells. Endocrinology. 159 (9), 3177-3186 (2018).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
- Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353 (6302), 925-928 (2016).
- Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224 (2018).
