Här presenterar vi ett protokoll för att generera högkvalitativa, storskaliga transkriptome data av enskilda celler från isolerade mänskliga pankreasöar med hjälp av en droplet-baserade mikrofluidic Single-cell RNA sekvensering teknik.
Pankreasöar består av endokrina celler med distinkta hormon uttrycksmönster. De endokrina cellerna uppvisar funktionella skillnader som svar på normala och patologiska tillstånd. Målet med detta protokoll är att generera högkvalitativa, storskaliga transkriptome data av varje endokrin celltyp med hjälp av en droplet-baserade mikroflödessystem Single-cell RNA sekvensering teknik. Sådana data kan utnyttjas för att bygga gen uttrycks profil av varje endokrin celltyp i normala eller specifika förhållanden. Processen kräver noggrann hantering, noggrann mätning och noggrann kvalitetskontroll. I detta protokoll beskriver vi detaljerade steg för mänskliga pankreasöar dissociation, sekvensering och dataanalys. De representativa resultaten av cirka 20 000 humana singelcellöar visar att protokollet har genomförts framgångsrikt.
Pankreasöar släppa endokrina hormoner för att reglera blodsockernivåerna. Fem endokrina celltyper, som skiljer sig funktionellt och morfologiskt, är involverade i denna viktiga roll: α-celler producerar glukagon, β-cells insulin, δ-cells somatostatin, PP-celler pankreaspolypeptid och ε-celler ghrelin1. Profilering av genuttryck är en användbar metod för att karakterisera de endokrina cellerna under normala eller specifika förhållanden. Historiskt sett har hela Holmen gen uttrycks profilering genererats med hjälp av microarray och Next-generation RNA-sekvensering2,3,4,5,6,7 , 8. även om hela Holmen transkriptome är informativ för att identifiera organspecifika utskrifter och sjukdomar kandidat gener, det misslyckas med att avslöja molekyl heterogenitet av varje ö-celltyp. Laser Capture microdissection (LCM) teknik har tillämpats för att direkt erhålla specifika celltyper från öar9,10,11,12 men inte är av renhet av den riktade cellen Befolkningen. För att övervinna dessa begränsningar har fluorescensaktiverad cell sortering (FACS) använts för att välja specifika endokrina cellpopulationer, såsom α-och β-celler13,14,15,16 , 17 , 18. Dessutom använde dorrell et al. en antikroppsbaserad FACS sortering metod för att klassificera β-celler i fyra subpopulationer19. FACS-sorterade ö-celler kan också pläteras för RNA-sekvensering av enstaka celler; dock ställs plattbaserade metoder inför utmaningar i skalbarheten20,21,22.
För att generera hög kvalitet, storskaliga transkriptome data av varje endokrin celltyp, tillämpade vi mikroflödessystem teknik för att mänskliga ö-celler. Den mikroflödessystem plattformen genererar transkriptome data från ett stort antal enskilda celler i ett högt dataflöde, hög kvalitet, och skalbara sätt23,24,25,26,27. Förutom att avslöja molekylära egenskaper hos en celltyp som fångas i en stor mängd, möjliggör mycket skalbar mikroflödessystem-plattform identifiering av sällsynta celltyper när tillräckligt många celler tillhandahålls. Därför, tillämpning av plattformen till mänskliga pankreasöar tillät profilering av ghrelin-utsöndra ε-celler, en sällsynt endokrin celltyp med föga känd funktion på grund av dess brist28. Under de senaste åren har flera studier publicerats av oss och andra som rapporterar storskaliga transkriptomdata från humana öar med hjälp av tekniken29,30,31,32, 33. Uppgifterna är allmänt tillgängliga och användbara resurser för Holmen samfundet att studera endokrina cellers heterogenitet och dess konsekvenser för sjukdomar.
Här beskriver vi en droplet-baserade mikroflödessystem Single-cell RNA sekvenserings protokoll, som har använts för att producera transkriptome data av cirka 20 000 mänskliga öar celler inklusive α-, β-, δ-, PP, ε-celler, och en mindre andel av icke-endokrina celler 32. arbetsflödet börjar med isolerade mänskliga öar och skildrar steg av holme cell dissociation, Single-cell Capture, och dataanalys. Protokollet kräver användning av nyligen isolerade öar och kan tillämpas på öar från människor och andra arter, såsom gnagare. Använda detta arbetsflöde, opartisk och omfattande Holmen cell Atlas under baslinjen och andra villkor kan byggas.
Single-cell-teknik som utvecklats under de senaste åren ger en ny plattform för att karakterisera celltyper och studera molekylära heterogenitet i mänskliga pankreasöar. Vi antog ett protokoll av droplet-baserade mikroflödessystem Single-cell isolering och dataanalys för att studera mänskliga öar. Vårt protokoll producerade framgångsrikt RNA-sekvenserings data från över 20 000 enstaka humana ö-celler med relativt små variationer i sekvenskvalitet och batcheffekter.
I synnerhet ?…
The authors have nothing to disclose.
Ingen
30 µm Pre-Separation Filters | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | Cell strainer |
8-chamber slides | Chemometec | 102673-680 | Dell counting assay slides |
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | for QC |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | Single cell media |
Chromium Single Cell 3' Library & Gel Bead Kit v2, 16 rxns | 10X Genomics | 120237 | Single cell reagents |
Chromium Single Cell A Chip Kit v2, 48 rx (6 chips) | 10X Genomics | 120236 | Microfluidic chips |
CMRL-1066 | ThermoFisher | 11530-037 | Complete islet media |
EB Buffer | Qiagen | 19086 | Elution buffer |
Eppendorf twin-tec PCR plate, 96-well, blue, semi-skirted | VWR | 47744-112 | Emulsion plate |
Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000-036 | Complete islet media |
Human islets | Prodo Labs | HIR | Isolated human islets |
L-Glutamine (200 mM) | ThermoFisher | 25030-081 | Complete islet media |
Nextera DNA Library Preparation Kit (96 samples) | Illumina | FC-121-1031 | Library preparation reagents |
NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 cycles) | Illumina | FC-404-2005 | Sequencing |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140-122 | Complete islet media |
Qubit High Sensitivity dsDNA Kit | Life Technologies | Q32854 | for QC |
Solution 18 | Chemometec | 103011-420 | Cell counting assay reagent |
SPRISelect Reagent | Fisher Scientific | B23318 | Purification beads |
Tissue Culture Dishes (10 cm) | VWR | 10861-594 | for islet culture |
TrypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | Cell dissociation solution |
Zymo DNA Clean & Concentrator-5, 50 reactions | VWR | 77001-152 | Library clean up columns |