Caractérisation semi-automatique De MD-L1 et recensement des cellules tumorales circulantes de patients atteints d'immunofluorescence
Summary
La caractérisation des cellules tumorales circulantes (CTC) est un sujet populaire dans la recherche translationnelle. Ce protocole décrit un test semi-automatique d’immunofluorescence (IF) pour la caractérisation de PD-L1 et l’énumération des CTC dans les échantillons patients de cancer de poumon de non-petite cellule (NSCLC).
Abstract
Les cellules tumorales circulantes (CTC) dérivées de la tumeur primaire sont jetées dans la circulation sanguine ou le système lymphatique. Ces cellules rares (1 à 10 cellules par ml de sang) justifient un mauvais pronostic et sont corrélées avec une survie globale plus courte dans plusieurs cancers (p. ex. le sein, la prostate et le cancer colorectal). À l’heure actuelle, le système de capture à base de perles magnétiques anti-EpCAM est le test de référence approuvé par la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis pour l’énumération des CCT dans la circulation sanguine. Ce test est basé sur l’utilisation de perles magnétiques recouvertes de marqueurs anti-EpCAM, qui ciblent spécifiquement les cellules cancéreuses épithéliales. De nombreuses études ont montré qu’EpCAM n’est pas le marqueur optimal pour la détection de la CCT. En effet, les CTC sont une sous-population hétérogène de cellules cancéreuses et sont capables de subir une transition épithéliale à mésenchymale (EMT) associée à la prolifération métastatique et à l’invasion. Ces CTC sont capables de réduire l’expression du marqueur épithélial de surface cellulaire EpCAM, tout en augmentant les marqueurs mésenchymal tels que la vimentine. Pour surmonter cet obstacle technique, d’autres méthodes d’isolement fondées sur les propriétés physiques des CCT ont été mises au point. Les technologies microfluidiques permettent une approche sans étiquette de l’enrichissement de la CCT à partir d’échantillons de sang entier. La technologie microfluidique spirale utilise les forces de traînée inertielles et Dean avec un flux continu dans les canaux incurvés générés dans une puce microfluidique spirale. Les cellules sont séparées en fonction des différences de taille et de plasticité entre les cellules sanguines normales et les cellules tumorales. Ce protocole détaille les différentes étapes pour caractériser l’expression programmée de la ligand de la mort 1 (PD-L1) des CTC, combinant un dispositif microfluidique en spirale avec l’ensemble de marqueurs d’immunofluorescence personnalisable (IF).
Introduction
Les lymphocytes T cytotoxiques (CTL) spécifiques à l’antigène tumoral jouent un rôle crucial dans la réponse aux cancers par le biais d’un processus connu sous le nom de « surveillance immunitaire » du cancer. Leurs fonctions antitumorales sont renforcées par des anticorps de blocus de point de contrôle immunitaire tels que les inhibiteurs cTLA-4 et les inhibiteurs De PD-1/PD-L1. Dans le cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC), les thérapies anti-PD-1/PD-L1 ont comme conséquence des taux de réponse s’étendant de 0%-17% dans les patients présentant des tumeurs PD-L1-négatives et 36%-100% dans ceux exprimant PD-L1. Les réponses robustes au blocus de PD-1/PD-L1 observées dans le mélanome et NSCLC sont montrées par l’évidence du taux global amélioré de réponse (RR), des avantages cliniques durables, et de la survie sans progression (PFS). À l’heure actuelle, les traitements anti-PD1 sont la norme de soins dans le traitement de deuxième intention avec le nivolumab indépendamment de l’expression PD-L1 et avec le pembrolizumab chez les patients exprimant PD-L1 -1%. Dans le traitement de première ligne, la norme de soins est le pembrolizumab seul chez les patients atteints de NSCLC exprimant PD-L1 50% et peut être potentiellement améliorée avec la chimiothérapie (platin et médicament doublet selon le sous-type histologique)1,2.
Cependant, une telle approche à lagestion patiente est discutable 3, puisque l’expression de PD-L1 dans les cellules de tumeur par immunohistochemistry (IHC) n’est probablement pas le biomarqueur de compagnon le plus idéal. D’autres tels que la charge de mutation de tumeur4 (TMB), l’instabilité de microsatellite (MSI), et/ou le microbiote sont probablement intéressants dans ce arrangement seul ou en combinaison. NSCLC sont connus pour être des tumeurs hétérogènes, soit spatialement (d’un site de tumeur à un autre) ou temporellement (du diagnostic à la répétition). Les patients atteints de NSCLC sont généralement fragiles, et les biopsies invasives itératives de tissu peuvent être un problème. En effet, le taux de rebiopsie à la première progression varie de 46% à 84% selon les séries, et la re-biopsie réussie (c’est-à-dire avec une analyse histologique et moléculaire complète) varie de 33% à 75%. Cela signifie que 25%-67% des patients ne peuvent pas recevoir une analyse complète de re-biopsie au cours de la première progression5,6,7,8.
L’avènement des « biopsies liquides » a ainsi suscité un enthousiasme considérable dans ce contexte particulier, car il permet une réévaluation cruciale des altérations moléculaires lors de la progression de la maladie en examinant l’ADN libre circulant (aDNc) dérivé de la circulation cellules tumorales (CTC). Ces cellules vivantes sont libérées de la tumeur dans la circulation sanguine, où elles circulent librement. Bien qu’elle ne soit pas couramment utilisée, l’analyse des CCT semble très prometteuse dans le cas de la caractérisation moléculaire et phénotypique, du pronostic et de l’importance prédictive dans le cancer du poumon (via DNAseq, RNAseq, miRNA et analyse des protéines). En effet, les CTC abritent probablement des caractéristiques phénotypiques de la maladie active plutôt que les marqueurs initiaux (détectés sur les biopsies tissulaires au moment du diagnostic). En outre, les CTC détournent le problème de l’hétérogénéité spatiale du tissu tumoral, qui peut être un problème crucial dans de petites biopsies. Par conséquent, l’expression de PD-L1 sur des CTC peut potentiellement jeter la lumière sur les écarts dérivés de son utilisation comme biomarqueur prédictif utilisant le tissu de tumeur.
Récemment, l’expression PD-L1 a été testée dans les CCT de NSCLC. Presque tous les patients examinés9 étaient Positifs de PD-L1, compliquant l’interprétation du résultat et de son utilisation clinique. Dans l’ensemble, des CTC positifs au PD-L1 ont été détectés dans 69,4 % des échantillons provenant d’une moyenne de 4,5 cellules/mL10. Après l’initiation de la radiothérapie, la proportion de CTC PD-L1-positifs a augmenté de manière significative, indiquant la régulation vers le haut de l’expression de PD-L1 en réponse au rayonnement11. Par conséquent, l’analyse de CTC de PD-L1 peut être employée pour surveiller des changements dynamiques de la tumeur et de la réponse immunitaire, qui peuvent refléter la réponse à la chimiothérapie, à la radiothérapie, et aux traitements probables d’immunothérapie (IT).
À ce jour, l’isolement des CCT et la caractérisation de la DPc-L1 s’appuient sur diverses méthodes telles que lacapture de perles magnétiques à base de perles magnétiques anti-EpCAM, l’analyse basée sans enrichissement et la taille 12,13 essais de capture de la CCT. Cependant, les CTC n’ont été détectés que chez 45 à 65 % des patients atteints de NSCLC métastatique, ce qui limite leur capacité de fournir des renseignements à plus de la moitié des patients atteints de NSCLC métastatique. De plus, le nombre de CCT était faible dans la plupart de ces études en utilisant l’approche fondée sur la taille10. En outre, cette méthode a conduit à des divergences telles que la détection de cellules CD45(-)/DAPI(MD) avec des « modèles cytomorphologiques de malignité » dans la circulation sanguine de donneurs en bonne santé. Ces préoccupations soulignent la nécessité d’une méthode très sensible de collecte de la CCT associée au phénotypage immunitaire des cellules CD45(-) atypiques provenant de sang entier sain à l’aide de biomarqueurs du cancer supplémentaires (c.-à-d. TTF1, Vimentin, EpCAM et CD44) dans le NSCLC.
Par conséquent, nous avons évalué un dispositif microfluidique en spirale qui utilise des forces de traînée inertielles et dedoyen pour séparer les cellules en fonction de la taille et de la plasticité à l’intermédiaire d’une puce microfluidique. La formation des flux de vortex Dean présents dans la puce microfluidique donne lieu à de plus grandes CTC situées le long de la paroi intérieure et à de plus petites cellules immunitaires le long de la paroi extérieure de la puce. Le processus d’enrichissement est complété par le siphonnage des cellules plus grandes dans la prise de collecte comme la fraction de la CCT enrichie. Cette méthode est particulièrement sensible et spécifique (détection d’environ 1 CTC/mL de sang entier)14 et peut être associée à des analyses personnalisées d’immunofluorescence (IF). Ces outils permettront de mettre en place un seuil positif pour l’interprétation clinique. Un flux de travail est ainsi décrit qui permet aux biologistes d’isoler et d’immunophénotype CTC avec un taux élevé de récupération et de spécificité. Le protocole décrit l’utilisation optimale de l’appareil microfluidique en spirale pour recueillir les CTC, les tests IF optimisés qui peuvent être personnalisés selon le type de cancer, et l’utilisation de logiciels libres open-source pour mesurer et analyser les images cellulaires pour effectuer un semi-automatique numération des cellules en fonction de la coloration fluorescente. En outre, le multiplexage au microscope peut être effectué en fonction du nombre de filtres fluorescents/marqueurs disponibles.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deux points majeurs ont été soulevés dans la présente étude, le premier en ce qui concerne la performance du flux de travail pour son transfert à des applications cliniques, et le second concernant la diminution de la subjectivité pour l’analyse des images de fluorescence obtenues.
Un flux de travail performant et optimisé pour l’énumération de la CCT a d’abord été déterminé à l’aide d’un analyse FI personnalisable après enrichissement cellulaire par l’intermédiaire d’un syst?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions de recherche d’AstraZeneca (Londres, Royaume-Uni), Biolidics (Singapour) et la Ligue Contre le Cancer (Saone et Loire, France). Les auteurs remercient les entreprises AstraZeneca et Biolidics pour leur soutien financier.
Materials
| 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) | Ozyme | BLE 422801 | Storage conditions: +4°C |
| BD Facs Clean – 5L | BD Biosciences | 340345 | Bleach-based cleaning agent. Storage conditions: Room temperature |
| Bleach 1% Cleaning Solution 100 mL | Biolidics | CBB-F016012 | Bleach. Storage conditions: Room temperature |
| Bovine Serum Albumin (BSA) 7.5% | Sigma | A8412 | Storage conditions: +4°C |
| CD45 monoclonal antibody (clone HI30) Alexa Fluor 647 | BioLegend | BLE304020 | Storage conditions: +4°C |
| CellProfiler Software | Broad Institute | Image Analysis Software | |
| Centrifuge device | Hettich | 4706 | Storage conditions: Room temperature |
| Centrifuge tube 50 mL | Corning | 430-829 | Storage conditions: Room temperature |
| Centrifuge Tube 15 mL | Biolidics | CBB-F001004-25 | Storage conditions: Room temperature |
| ClearCell FX-1 System | Biolidics | CBB-F011002 | Spiral microfluidic device. Storage conditions: Room temperature |
| Coulter Clenz Cleaning Agent – 5L | Beckman Coulter | 8448222 | All-purpose cleaning reagent. Storage conditions: Room temperature |
| CTChip FR1S | Biolidics | CBB-FR001002 | Microfluidic chip. Storage conditions: Room temperature |
| Cytospin 4 | ThermoFisher | A78300003 | Storage conditions: Room temperature |
| Diluent Additive Reagent – 20 mL | Biolidics | CBB-F016009 | Storage conditions: +4°C |
| EZ Cytofunnels | ThermoFisher | A78710003 | Sample chamber with cotton. Storage conditions: Room temperature |
| FcR blocking Agent | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | Storage conditions: +4°C |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10270-106 | Storage conditions: +4°C |
| Fluoromount | Sigma | F4680 | Mounting solution. Storage conditions: Room temperature |
| Fungizone – 50 mg | Bristol-Myers-Squibb | 90129TB29 | Anti-fungal reagent. Storage conditions: +4°C |
| FX1 Input Straw with lock cap | Biolidics | CBB-F013005 | Straw. Storage conditions: Room temperature |
| KovaSlide | Dutscher | 50126 | Chambered slide. Storage conditions: Room temperature |
| PanCK monoclonal antibody (clone AE1/AE3) Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | 53-9003-80 | Storage conditions: +4°C |
| Paraformaldehyde 16% | ThermoFisher | 11490570 | Fixation solution. Storage conditions: +4°C |
| PD-L1 monoclonal antibody (clone 29E2A3) – Phycoerythrin | BioLegend | BLE329706 | Storage conditions: +4°C |
| Petri Dish | Dutscher | 632180 | Storage conditions: Room temperature |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Ozyme | BE17-512F | Storage conditions: +4°C |
| Phosphate Buffered Saline Ultra Pure Grade 1X – 1L | 1st Base Laboratory | BUF-2040-1X1L | Storage conditions: Room temperature |
| Pluronic F-68 10% | Gibco | 24040-032 | Anti-binding solution. Storage conditions: Room temperature |
| Polylysine slides | ThermoFisher | J2800AMNZ | Storage conditions: Room temperature |
| Polypropylene Conical Tube 50 mL | Falcon | 352098 | Storage conditions: Room temperature |
| RBC Lysis Buffer – 100 mL | G Biosciences | 786-649 | Storage conditions: +4°C |
| RBC Lysis Buffer – 250 mL | G Biosciences | 786-650 | Storage conditions: +4°C |
| Resuspension Buffer (RSB) | Biolidics | CBB-F016003 | Storage conditions: +4°C |
| Shandon Cytopsin4 centrifuge | ThermoFisher | A78300003 | Dedicated centrifuge. Storage conditions: Room temperature |
| Silicon Isolator | Grace bio-Labs | 664270 | Storage conditions: Room temperature |
| Sterile Deionized Water – 100 mL | 1st Base Laboratory | CUS-4100-100ml | Storage conditions: Room temperature |
| Straight Fluorescent microscope Axio Imager D1 | Zeiss | Storage conditions: Room temperature | |
| Surgical Sterile Bag | SPS Laboratoires | 98ULT01240 | Storage conditions: Room temperature |
| Syringe BD Discardit II 20 mL sterile | BD Biosciences | 300296 | Storage conditions: Room temperature |
| Syringe Filter 0.22 µm 33 mm sterile | ClearLine | 51732 | Storage conditions: Room temperature |
| Zen lite 2.3 Lite Software | Zeiss | Microscope associated software |
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