Полуавтоматический PD-L1 Характеристика и перечисление циркулирующих опухолевых клеток от немелкоклеточных больных раком легких по иммунофлуоресценции
Summary
Характеристика циркулирующих опухолевых клеток (КТК) является популярной темой в трансляционных исследованиях. Этот протокол описывает полуавтоматический иммунофлуоресценции (IF) анализ для PD-L1 характеристики и перечисления CTCs в немелкоклеточного рака легких (NSCLC) образцов пациентов.
Abstract
Циркулирующие опухолевые клетки (КТК), полученные из первичной опухоли, проливаются в кровоток или лимфатическую систему. Эти редкие клетки (1–10 клеток на мл крови) требуют плохого прогноза и коррелируют с более коротким общим выживаемостью при нескольких видах рака (например, груди, простаты и колоректальной). В настоящее время, анти-EpCAM покрытием магнитного биса основе CTC захвата системы является золотой стандарт тест, утвержденный США пищевых продуктов и медикаментов (FDA) для перечисления CTCs в крови. Этот тест основан на использовании магнитных бусин, покрытых анти-EpCAM маркеров, которые специально нацелены на эпителиальные раковые клетки. Многие исследования показали, что EpCAM не является оптимальным маркером для обнаружения КТК. Действительно, КТК являются неоднородной субпопуляцией раковых клеток и способны пройти эпителиальный переход к мезенхимальному переходу (ЭМТ), связанный с метастатическим распространением и вторжением. Эти CTCs способны уменьшить выражение эпителиального маркера поверхности клетки EpCAM, в то время как увеличение мезенхимальных маркеров, таких как виментин. Для устранения этого технического препятствия были разработаны другие методы изоляции, основанные на физических свойствах КТК. Микрофлюидические технологии позволяют без маркировки подходить к обогащению КТК из цельных образцов крови. Спиральная микрофлюидная технология использует инерционные и динские силы сопротивления с непрерывным потоком в изогнутых каналах, генерируемых внутри спирального микрофлюидного чипа. Клетки разделены на основе различий в размерах и пластичности между нормальными клетками крови и опухолевыми клетками. Этот протокол детализирует различные шаги, чтобы охарактеризовать запрограммированное выражение КТК, запрограммированное смертельным лигандом 1 (PD-L1), сочетающее спиральное микрофлюидическое устройство с настраиваемым набором маркеров иммунофлюоресценции (ИФ).
Introduction
Опухолевые антиген-специфические цитотоксические Т-лимфоциты (КТЛ) играют решающую роль в ответ на рак через процесс, известный как рак “иммунного эпиднадзора”. Их противоопухолевые функции усиливаются антителами блокады иммунных контрольно-пропускных пунктов, такими как ингибиторы CTLA-4 и ингибиторы PD-1/PD-L1. При немелкоклеточном раке легких (NSCLC) анти-PD-1/PD-L1 терапии приводят к реакции ставки от 0%-17% у пациентов с PD-L1-отрицательных опухолей и 36%-100% в тех, кто выражает PD-L1. Надежные реакции на pd-1/PD-L1 блокады наблюдается в меланомы и NSCLC показаны доказательства улучшения общего уровня ответов (RR), прочные клинические преимущества, и прогрессии свободной выживания (PFS). В настоящее время, анти-PD1 лечения являются стандартом ухода в второй линии NSCLC лечение ниволумаб независимо от экспрессии PD-L1 и с pembrolizumab у пациентов, выражающих PD-L1 1%. В первой линии лечения, стандарт ухода pembrolizumab только у пациентов с NSCLC выражения PD-L1 50% и может быть потенциально повышена с помощью химиотерапии (платиновый и дублет препарат в зависимости от гистологического подтипа)1,2.
Тем не менее, такой подход к управлению пациентом является спорным3, так как PD-L1 выражение в опухолевых клетках иммуногистохимии (IHC), вероятно, не самый идеальный спутник биомаркера. Другие, такие как бремя мутации опухоли4 (TMB), микроспутниковой нестабильности (MSI), и / или микробиоты, возможно, интересны в этой обстановке либо в одиночку или в сочетании. NSCLC, как известно, неоднородные опухоли, либо пространственно (от опухоли к другому) или временно (от диагноза до рецидива). Пациенты с NSCLC, как правило, хрупкие, и итеративные инвазивные биопсии тканей может быть проблемой. Действительно, скорость повторной биопсии при первом прогрессии колеблется от 46%-84% в зависимости от серии, а успешная повторная биопсия (имеется в виду гистологический и полный молекулярный анализ) колеблется от 33%-75%. Это означает, что 25%-67% пациентов не могут получить комплексный анализ повторной биопсии во время первой прогрессии5,6,7,8.
Появление “жидкой биопсии”, таким образом, вызвало значительный энтузиазм в этой конкретной обстановке, так как это позволяет решающую переоценку молекулярных изменений во время прогрессирования заболевания путем изучения циркулирующих свободной ДНК (cfDNA), полученных из циркулирующих опухолевых клеток (СтК). Эти живые клетки высвобождаются из опухоли в кровоток, где они свободно циркулируют. Хотя анализ кТК обычно не используется, он представляется весьма перспективным в случае молекулярной и фенотипической характеристики, прогноза и прогностического значения при раке легких (через DNAseq, RNAseq, miRNA и анализ белка). Действительно, КТК, вероятно, гавани фенотипические характеристики активного заболевания, а не первоначальные маркеры (обнаруженные на биопсии тканей при постановке диагноза). Кроме того, КТК обходят проблему пространственной неоднородности опухолевой ткани, которая может быть ключевой проблемой при мелкой биопсии. Следовательно, выражение PD-L1 на КТК потенциально может пролить свет на расхождения, полученные от его использования в качестве прогностического биомаркера с использованием опухолевой ткани.
Недавно выражение PD-L1 было протестировано в КТК NSCLC. Почти все пациенты, протестированные9 были PD-L1 положительными, усложняя интерпретацию результата и его клинического использования. В целом, PD-L1-положительные CtCs были обнаружены в 69,4% образцов из в среднем 4,5 клеток / мл10. После начала лучевой терапии, доля PD-L1-положительных КТК значительно увеличилась, что свидетельствует об усилении экспрессии PD-L1 в ответ на излучение11. Таким образом, анализ PD-L1 CTCs может быть использован для мониторинга динамических изменений опухоли и иммунного ответа, которые могут отражать реакцию на химиотерапию, облучение и, вероятно, иммунотерапии (ИТ) лечения.
На сегодняшний день изоляция CTCs и pd-L1 характеристики опираются на различные методы, такие как анти-EpCAM покрытием магнитного биса основе CTC захвата, обогащения основе анализ, и размер на основе12,13 CTC захвата анализов. Тем не менее, КТК были обнаружены только у 45%-65% пациентов с метастатическим NSCLC, тем самым ограничивая их способность предоставлять любую информацию для более чем половины метастатических пациентов NSCLC. Кроме того, количество КТК было низким в большинстве из этих исследований с использованием размера на основе подхода10. Кроме того, этот метод привел к расхождениям, таким как обнаружение клеток CD45(-)/DAPI с “цитоморфологическими моделями злокачественных новообразований” в крови здоровых доноров. Эти опасения подчеркивают необходимость высокочувствительного метода сбора КТК, связанного с иммунной фенотипированием нетипичных клеток CD45(-) из здоровой цельной крови с использованием дополнительных биомаркеров рака (т.е. TTF1, Vimentin, EpCAM и CD44) в NSCLC.
Следовательно, мы оценили спиральный микрофлюидное устройство, которое использует инерционные и Дин перетащить силы для разделения клеток на основе размера и пластичности через микрофлюидный чип. Формирование вихря Дена, присутствующих в микрофлюидных чипов приводит к большей CTCs, расположенных вдоль внутренней стены и меньших иммунных клеток вдоль внешней стены чипа. Процесс обогащения завершается севодок больших клеток в коллекционную розетку в качестве обогащенной фракции CtC. Этот метод является особенно чувствительным и специфическим (обнаружение около 1 КТК/мл цельной крови)14 и может быть связан с индивидуальными иммунофлюоресценции (ИФ) анализами. Эти инструменты позволят установить положительный порог для клинического толкования. Таким образом, описывается рабочий процесс, который позволяет биологам изолировать и иммунофенотип CtCs с высоким уровнем восстановления и специфичности. Протокол описывает оптимальное использование спирального микрофлюидного устройства для сбора КТК, оптимизированные анализы IF, которые могут быть настроены в соответствии с типом рака, и использование свободного программного обеспечения с открытым исходным кодом для измерения и анализа клеточных изображений для выполнения полуавтоматического нумерация клеток в соответствии с флуоресцентным окрашиванием. Кроме того, мультиплексирование микроскопа может осуществляться в зависимости от количества доступных флуоресцентных фильтров/маркеров.
Protocol
Representative Results
Discussion
В настоящем исследовании были подняты два основных вопроса: первый в отношении эффективности рабочего процесса для его передачи в клинические приложения, а второй – снижение субъективности анализа полученных изображений флуоресценции.
Перформатора и оптимизированный …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана научно-исследовательскими грантами от Компании АстраЗенека (Лондон, Соединенное Королевство), Biolidics (Сингапур) и Ligue Contre le Cancer (Saone et Loire, Франция). Авторы благодарят компании «АстраЗенека» и «Биолидика» за финансовую поддержку.
Materials
| 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) | Ozyme | BLE 422801 | Storage conditions: +4°C |
| BD Facs Clean – 5L | BD Biosciences | 340345 | Bleach-based cleaning agent. Storage conditions: Room temperature |
| Bleach 1% Cleaning Solution 100 mL | Biolidics | CBB-F016012 | Bleach. Storage conditions: Room temperature |
| Bovine Serum Albumin (BSA) 7.5% | Sigma | A8412 | Storage conditions: +4°C |
| CD45 monoclonal antibody (clone HI30) Alexa Fluor 647 | BioLegend | BLE304020 | Storage conditions: +4°C |
| CellProfiler Software | Broad Institute | Image Analysis Software | |
| Centrifuge device | Hettich | 4706 | Storage conditions: Room temperature |
| Centrifuge tube 50 mL | Corning | 430-829 | Storage conditions: Room temperature |
| Centrifuge Tube 15 mL | Biolidics | CBB-F001004-25 | Storage conditions: Room temperature |
| ClearCell FX-1 System | Biolidics | CBB-F011002 | Spiral microfluidic device. Storage conditions: Room temperature |
| Coulter Clenz Cleaning Agent – 5L | Beckman Coulter | 8448222 | All-purpose cleaning reagent. Storage conditions: Room temperature |
| CTChip FR1S | Biolidics | CBB-FR001002 | Microfluidic chip. Storage conditions: Room temperature |
| Cytospin 4 | ThermoFisher | A78300003 | Storage conditions: Room temperature |
| Diluent Additive Reagent – 20 mL | Biolidics | CBB-F016009 | Storage conditions: +4°C |
| EZ Cytofunnels | ThermoFisher | A78710003 | Sample chamber with cotton. Storage conditions: Room temperature |
| FcR blocking Agent | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | Storage conditions: +4°C |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10270-106 | Storage conditions: +4°C |
| Fluoromount | Sigma | F4680 | Mounting solution. Storage conditions: Room temperature |
| Fungizone – 50 mg | Bristol-Myers-Squibb | 90129TB29 | Anti-fungal reagent. Storage conditions: +4°C |
| FX1 Input Straw with lock cap | Biolidics | CBB-F013005 | Straw. Storage conditions: Room temperature |
| KovaSlide | Dutscher | 50126 | Chambered slide. Storage conditions: Room temperature |
| PanCK monoclonal antibody (clone AE1/AE3) Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | 53-9003-80 | Storage conditions: +4°C |
| Paraformaldehyde 16% | ThermoFisher | 11490570 | Fixation solution. Storage conditions: +4°C |
| PD-L1 monoclonal antibody (clone 29E2A3) – Phycoerythrin | BioLegend | BLE329706 | Storage conditions: +4°C |
| Petri Dish | Dutscher | 632180 | Storage conditions: Room temperature |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Ozyme | BE17-512F | Storage conditions: +4°C |
| Phosphate Buffered Saline Ultra Pure Grade 1X – 1L | 1st Base Laboratory | BUF-2040-1X1L | Storage conditions: Room temperature |
| Pluronic F-68 10% | Gibco | 24040-032 | Anti-binding solution. Storage conditions: Room temperature |
| Polylysine slides | ThermoFisher | J2800AMNZ | Storage conditions: Room temperature |
| Polypropylene Conical Tube 50 mL | Falcon | 352098 | Storage conditions: Room temperature |
| RBC Lysis Buffer – 100 mL | G Biosciences | 786-649 | Storage conditions: +4°C |
| RBC Lysis Buffer – 250 mL | G Biosciences | 786-650 | Storage conditions: +4°C |
| Resuspension Buffer (RSB) | Biolidics | CBB-F016003 | Storage conditions: +4°C |
| Shandon Cytopsin4 centrifuge | ThermoFisher | A78300003 | Dedicated centrifuge. Storage conditions: Room temperature |
| Silicon Isolator | Grace bio-Labs | 664270 | Storage conditions: Room temperature |
| Sterile Deionized Water – 100 mL | 1st Base Laboratory | CUS-4100-100ml | Storage conditions: Room temperature |
| Straight Fluorescent microscope Axio Imager D1 | Zeiss | Storage conditions: Room temperature | |
| Surgical Sterile Bag | SPS Laboratoires | 98ULT01240 | Storage conditions: Room temperature |
| Syringe BD Discardit II 20 mL sterile | BD Biosciences | 300296 | Storage conditions: Room temperature |
| Syringe Filter 0.22 µm 33 mm sterile | ClearLine | 51732 | Storage conditions: Room temperature |
| Zen lite 2.3 Lite Software | Zeiss | Microscope associated software |
References
- Gandhi, L., et al. Pembrolizumab plus Chemotherapy in Metastatic Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 378 (22), 2078-2092 (2018).
- Paz-Ares, L., et al. Pembrolizumab plus Chemotherapy for Squamous Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 379 (21), 2040-2051 (2018).
- Langer, C. J., et al. Carboplatin and pemetrexed with or without pembrolizumab for advanced, non-squamous non-small-cell lung cancer: a randomised, phase 2 cohort of the open-label KEYNOTE-021 study. The Lancet Oncology. 17 (11), 1497-1508 (2016).
- Hellmann, M. D., et al. Tumor Mutational Burden and Efficacy of Nivolumab Monotherapy and in Combination with Ipilimumab in Small-Cell Lung Cancer. Cancer Cell. 33 (5), 853-861 (2018).
- Chouaid, C., et al. Feasibility and clinical impact of re-biopsy in advanced non small-cell lung cancer: a prospective multicenter study in a real-world setting (GFPC study 12-01). Lung cancer. 86 (2), 170-173 (2014).
- Nosaki, K., et al. Re-biopsy status among non-small cell lung cancer patients in Japan: A retrospective study. Lung cancer. 101, 1-8 (2016).
- Uozu, S., et al. Feasibility of tissue re-biopsy in non-small cell lung cancers resistant to previous epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor therapies. BMC Pulmonary Medicine. 17 (1), 175 (2017).
- Kim, T. O., et al. Feasibility of re-biopsy and EGFR mutation analysis in patients with non-small cell lung cancer. Thoracic Cancer. 9 (7), 856-864 (2018).
- Nicolazzo, C., et al. Monitoring PD-L1 positive circulating tumor cells in non-small cell lung cancer patients treated with the PD-1 inhibitor Nivolumab. Scientific Reports. 6, 31726 (2016).
- Guibert, N., et al. PD-L1 expression in circulating tumor cells of advanced non-small cell lung cancer patients treated with nivolumab. Lung cancer. 120, 108-112 (2018).
- Wang, Y., et al. PD-L1 Expression in Circulating Tumor Cells Increases during Radio(chemo)therapy and Indicates Poor Prognosis in Non-small Cell Lung Cancer. Scientific Reports. 9 (1), 566 (2019).
- Hao, S. -. J., Wan, Y., Xia, Y. -. Q., Zou, X., Zheng, S. -. Y. Size-based separation methods of circulating tumor cells. Advanced Drug Delivery Reviews. 125, 3-20 (2018).
- Williams, A., Balic, M., Datar, R., Cote, R. Size-based enrichment technologies for CTC detection and characterization. Recent results in cancer research. Fortschritte der Krebsforschung. Progres dans les recherches sur le cancer. 195, 87-95 (2012).
- Garcia, J., et al. Profiling of Circulating Tumor DNA (ctDNA) in Plasma of non-small cell lung cancer (NSCLC) patients, Monitoring of EGFR p.T790M mutated allelic fraction using BEAMing Companion Assay and Evaluation in future application in mimicking Circulating Tumors Cells (mCTC). Cancer Medicine. , (2019).
- Garcia, J., et al. Evaluation of pre-analytical conditions and comparison of the performance of several digital PCR assays for the detection of major EGFR mutations in circulating DNA from non-small cell lung cancers: the CIRCAN_0 study. Oncotarget. 8 (50), 87980-87996 (2017).
- Lustberg, M. B., et al. Heterogeneous atypical cell populations are present in blood of metastatic breast cancer patients. Breast Cancer Research. 16 (2), 23 (2014).
- Ilie, M., et al. “Sentinel” circulating tumor cells allow early diagnosis of lung cancer in patients with chronic obstructive pulmonary disease. PLoS ONE. 9 (10), 111597 (2014).
- Khoo, B. L., et al. Clinical validation of an ultra high-throughput spiral microfluidics for the detection and enrichment of viable circulating tumor cells. PLoS ONE. 9 (7), 99409 (2014).
- Heymann, J. J., et al. PD-L1 expression in non-small cell lung carcinoma: Comparison among cytology, small biopsy, and surgical resection specimens. Cancer Cytopathology. 125 (12), 896-907 (2017).
- Biswas, A., et al. Clinical performance of endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration for assessing programmed death ligand-1 expression in nonsmall cell lung cancer. Diagnostic Cytopathology. 46 (5), 378-383 (2018).
- Buttner, R., et al. Programmed Death-Ligand 1 Immunohistochemistry Testing: A Review of Analytical Assays and Clinical Implementation in Non-Small-Cell Lung Cancer. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 35 (34), 3867-3876 (2017).
