İmmünfluoresans Ile Küçük Hücreli Olmayan Akciğer Kanseri Hastalarından Dolaşımdaki Tümör Hücrelerinin Yarı Otomatik PD-L1 Karakterizasyonu ve Numaralandırılması
Summary
Dolaşımdaki tümör hücrelerinin (CtCs) karakterizasyonu çeviri araştırmalarında popüler bir konudur. Bu protokol, küçük hücreli dışı akciğer kanseri (NSCLC) hasta örneklerinde PD-L1 karakterizasyonu ve KTK’ların numaralandırılması için yarı otomatik immünoresans (IF) tahtını tanımlar.
Abstract
Primer tümörden elde edilen dolaşımdaki tümör hücreleri (CtCs) kan dolaşımına veya lenfatik sisteme dökülür. Bu nadir hücreler (mL başına kan başına 1−10 hücre) kötü bir prognoz garanti ve çeşitli kanserlerde kısa genel sağkalım ile ilişkilidir (örneğin, meme, prostat ve kolorektal). Şu anda, anti-EpCAM kaplı manyetik boncuk tabanlı CTC yakalama sistemi kan dolaşımında CTC’ler sayısaliçin ABD Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) tarafından onaylanan altın standart testtir. Bu test, özellikle epitel kanseri hücrelerini hedef leyen anti-EpCAM belirteçleri ile kaplanmış manyetik boncukların kullanımına dayanmaktadır. Birçok çalışma EpCAM CTC tespiti için en uygun belirteç olmadığını gösterdi. Gerçekten de, CtCs kanser hücrelerinin heterojen bir alt popülasyon ve metastatik proliferasyon ve invazyon ile ilişkili bir epitelyal-mesenkimal geçiş (EMT) geçmesi edebiliyoruz. Bu CtCs hücre yüzeyi epitel marker EpCAM ifadesini azaltmak mümkün, vimentin gibi mezenkimal belirteçleri artırırken. Bu teknik engeli gidermek için, CTC’lerin fiziksel özelliklerine dayalı diğer izolasyon yöntemleri geliştirilmiştir. Mikroakışkan teknolojiler, tam kan örneklerinden CTC zenginleştirme için etiketsiz bir yaklaşım sağlar. Spiral mikroakışkan teknolojisi, spiral mikroakışkan çip içinde oluşturulan kavisli kanallarda sürekli akış ile atalet ve Dean sürükleme kuvvetleri kullanır. Hücreler normal kan hücreleri ve tümöral hücreler arasındaki boyut ve plastisite farklılıklarına göre ayrılır. Bu protokol, ctcs programlanmış ölüm-ligand 1 (PD-L1) ekspresyonu karakterize etmek için farklı adımları ayrıntıları, özelleştirilebilir immünoreskence ile spiral mikroakışkan cihaz birleştirerek (IF) marker seti.
Introduction
Tümör antijene özgü sitotoksik T-lenfositler (CtLs) kanser “bağışıklık gözetimi” olarak bilinen bir süreç yoluyla kanserlere yanıt önemli bir rol oynamaktadır. Anti-tümör fonksiyonları, CTLA-4 inhibitörleri ve PD-1/PD-L1 inhibitörleri gibi immün kontrol noktası blokantikorları ile geliştirilmiştir. Küçük hücreli dışı akciğer kanserinde (NSCLC), anti-PD-1/PD-L1 tedavileri, PD-L1 negatif tümörlü hastalarda %0-17, PD-L1’i ifade eden hastalarda ise %36-100 arasında değişen yanıt oranlarıile sonuçlanır. Melanom ve NSCLC’de gözlenen PD-1/PD-L1 ablukasına verilen sağlam yanıtlar, genel yanıt oranının (RR), dayanıklı klinik faydalar ve progresyonsuz sağkalım (PFS) kanıtları ile gösterilmiştir. Şu anda, anti-PD1 tedavileri pd-L1 ekspresyonu ne olursa olsun nivolumab ile ikinci basamak NSCLC tedavisinde bakım standardı ve PD-L1 ≥1 ifade eden hastalarda pembrolizumab ile. Birinci basamak tedavide, pd-L1 ≥50′ yi ifade eden NSCLC’li hastalarda tek başına pembrolizumab bakım standardıdır ve potansiyel olarak kemoterapi ile geliştirilebilir (histolojik alt tipe bağlı olarak platin ve doublet ilaç)1,2.
Ancak, hasta yönetimine böyle bir yaklaşım tartışmalıdır3, immünohistokimya ile tümör hücrelerinde PD-L1 ekspresyonu beri (IHC) muhtemelen en ideal eşlik biyomarker değildir. Tümör mutasyon yükü4 (TMB), mikrouydu instabilitesi (MSI) ve/veya mikrobiyota gibi diğerleri bu ortamda muhtemelen tek başına veya birlikte ilginçtir. NSCLC heterojen tümörler olduğu bilinmektedir, ya mekansal (bir tümör sitesinden diğerine) ya da zamansal (tanıdan nüksiçin). NSCLC’li hastalar genellikle kırılgandır ve yinelemeli invaziv doku biyopsileri sorun olabilir. Nitekim seriye bağlı olarak ilk progresyonda rebiyopsi oranı %46-84 arasında, başarılı re-biyopsi (histolojik ve tam moleküler analiz ile anlam) %33-75 arasında değişmektedir. Bu, hastaların %25-67’sinin ilk progresyon sırasında kapsamlı bir rebiyopsi analizi alamadığı anlamına gelir5,6,7,8.
“Sıvı biyopsiler”in ortaya çıkışı, bu ortamda önemli bir heyecan yaratmıştır, çünkü dolaşımdan elde edilen serbest DNA’yı (cfDNA) inceleyerek hastalığın ilerlemesi sırasında moleküler değişikliklerin önemli ölçüde yeniden değerlendirilmesini sağlar. tümör hücreleri (CtCs). Bu canlı hücreler tümörden kan dolaşımına salınır ve serbestçe dolaşır. Rutin olarak kullanılmamasına rağmen, akciğer kanserinde moleküler ve phenotipik karakterizasyon, prognoz ve tahmine dayalı önemi (DNAseq, RNAseq, miRNA ve protein analiziyoluyla) açısından KTK’ların analizi son derece umut verici görünmaktadır. Gerçekten de, KTK’lar büyük olasılıkla ilk belirteçler yerine aktif hastalığın hevit özellikleri barındırır (tanı da doku biyopsileri üzerinde saptanmıştır). Ayrıca, CtCs tümör dokusunun mekansal heterojenite sorunu atlamak, hangi küçük biyopsiler önemli bir sorun olabilir. Sonuç olarak, CTCs pd-L1 ekspresyonu potansiyel tümör dokusu kullanarak bir tahmine dayalı biyomarker olarak kullanımından kaynaklanan tutarsızlıklar ışık tutabilir.
Son zamanlarda, PD-L1 ekspresyonu NSCLC’nin CTC’lerinde test edilmiştir. Test edilen hastaların hemen hemen hepsi 9’u PD-L1 pozitifti, bu da sonucun yorumlanmasını ve klinik kullanımını karmaşık hale getiriyordu. Genel olarak, PD-L1-pozitif KTK’lar ortalama 4,5 hücre/mL10’danalınan örneklerin %69.4’ünde saptandı. Radyasyon tedavisinin başlamasından sonra, PD-L1-pozitif KTC’lerin oranı önemli ölçüde artarak, radyasyona yanıt olarak PD-L1 ekspresyonunun yükseltilmesine işaret eder11. Bu nedenle, PD-L1 CtCs analizi tümör ve bağışıklık yanıtı dinamik değişiklikleri izlemek için kullanılabilir, hangi kemoterapi yanıtı yansıtabilir, radyasyon, ve olası immünoterapi (BT) tedaviler.
Bugüne kadar, CTCs izolasyon ve PD-L1 karakterizasyonu anti-EpCAM kaplı manyetik boncuk tabanlı CTC yakalama, zenginleştirme-ücretsiz tabanlı tahlil ve boyut tabanlı12,13 CTC yakalama tahlilleri gibi çeşitli yöntemlere dayanır. Ancak metastatik NSCLC’li hastaların sadece %45-65’inde KTK saptandı ve böylece metastatik NSCLC hastalarının yarısından fazlası için herhangi bir bilgi verme yetenekleri sınırlandı. Buna ek olarak, ctc sayısı boyut tabanlı yaklaşım10kullanarak bu çalışmaların çoğunda düşüktü. Ayrıca bu yöntem sağlıklı donörlerin kan dolaşımında “malignitenin sitomorfolojik paternleri” ile CD45(-)/DAPI(+) hücrelerinin saptanması gibi tutarsızlıklara yol açmıştır. Bu endişeler, NSCLC’de ek kanser biyobelirteçleri (yani, TTF1, Vimentin, EpCAM ve CD44) kullanarak sağlıklı tam kandan atipik CD45(-) hücrelerinin immün-fenotipleme ile ilişkili CTC toplama son derece hassas bir yöntem için ihtiyaç vurgulamak.
Sonuç olarak, bir mikroakışkan çip aracılığıyla boyut ve plastisite dayalı hücreleri ayırmak için atalet ve Dean sürükleme kuvvetleri kullanan bir spiral mikroakışkan cihaz değerlendirildi. Dekan girdabının oluşumu mikroakışkan çipte bulunan akıntılar, iç duvar boyunca bulunan daha büyük CtC’ler ve çipin dış duvarı boyunca daha küçük bağışıklık hücreleri ile sonuçlanır. Zenginleştirme işlemi, büyük hücrelerin zenginleştirilmiş CTC fraksiyonu olarak toplama çıkışına emilmesiyle tamamlanır. Bu yöntem özellikle hassas ve spesifiktir (yaklaşık 1 CTC/mL tam kan saptanması)14 ve özelleştirilmiş immünoresans (IF) analizleri ile ilişkili olabilir. Bu araçlar klinik yorumlama için olumlu bir eşik kurulmasını sağlayacaktır. Bu nedenle biyologların yüksek iyileşme hızı ve özgüllük le immünfenotip BTC’leri izole etmelerini ve immünofopoftip BtC’leri izole etmelerini sağlayan bir iş akışı tanımlanmıştır. Protokol, spiral mikroakışkan cihazın CTC’leri toplamak için optimal kullanımını, kanser türüne göre özelleştirilebilen optimize edilmiş IF testlerini ve yarı otomatik bir performans sergilemek için hücre görüntülerini ölçmek ve analiz etmek için ücretsiz açık kaynak yazılım kullanımını tanımlar. floresan boyama göre hücrelerin numeration. Buna ek olarak, mikroskop çoklama mevcut floresan filtreler / belirteçleri sayısına bağlı olarak yapılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada, ilki klinik uygulamalara aktarılması için iş akışının performansı, ikincisi ise elde edilen floresan görüntülerinin analizinde öznellik azalması ile ilgili iki önemli nokta ortaya konmuştür.
CTC numaralandırma için bir performant ve optimize edilmiş iş akışı başlangıçta ctc etiketsiz mikroakışkan sistem (spiral mikroakışkan cihaz) ile hücre zenginleştirme sonrası özelleştirilebilir IF tahlili kullanılarak belirlendi. Bu iş akışını kull…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma AstraZeneca (Londra, Birleşik Krallık), Biolidics (Singapur) ve Ligue Contre le Cancer (Saone et Loire, Fransa) araştırma hibeleri ile desteklenmiştir. Yazarlar AstraZeneca ve Biolidics şirketlerine mali desteklerinden ötürü teşekkür ediyorlar.
Materials
| 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) | Ozyme | BLE 422801 | Storage conditions: +4°C |
| BD Facs Clean – 5L | BD Biosciences | 340345 | Bleach-based cleaning agent. Storage conditions: Room temperature |
| Bleach 1% Cleaning Solution 100 mL | Biolidics | CBB-F016012 | Bleach. Storage conditions: Room temperature |
| Bovine Serum Albumin (BSA) 7.5% | Sigma | A8412 | Storage conditions: +4°C |
| CD45 monoclonal antibody (clone HI30) Alexa Fluor 647 | BioLegend | BLE304020 | Storage conditions: +4°C |
| CellProfiler Software | Broad Institute | Image Analysis Software | |
| Centrifuge device | Hettich | 4706 | Storage conditions: Room temperature |
| Centrifuge tube 50 mL | Corning | 430-829 | Storage conditions: Room temperature |
| Centrifuge Tube 15 mL | Biolidics | CBB-F001004-25 | Storage conditions: Room temperature |
| ClearCell FX-1 System | Biolidics | CBB-F011002 | Spiral microfluidic device. Storage conditions: Room temperature |
| Coulter Clenz Cleaning Agent – 5L | Beckman Coulter | 8448222 | All-purpose cleaning reagent. Storage conditions: Room temperature |
| CTChip FR1S | Biolidics | CBB-FR001002 | Microfluidic chip. Storage conditions: Room temperature |
| Cytospin 4 | ThermoFisher | A78300003 | Storage conditions: Room temperature |
| Diluent Additive Reagent – 20 mL | Biolidics | CBB-F016009 | Storage conditions: +4°C |
| EZ Cytofunnels | ThermoFisher | A78710003 | Sample chamber with cotton. Storage conditions: Room temperature |
| FcR blocking Agent | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | Storage conditions: +4°C |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10270-106 | Storage conditions: +4°C |
| Fluoromount | Sigma | F4680 | Mounting solution. Storage conditions: Room temperature |
| Fungizone – 50 mg | Bristol-Myers-Squibb | 90129TB29 | Anti-fungal reagent. Storage conditions: +4°C |
| FX1 Input Straw with lock cap | Biolidics | CBB-F013005 | Straw. Storage conditions: Room temperature |
| KovaSlide | Dutscher | 50126 | Chambered slide. Storage conditions: Room temperature |
| PanCK monoclonal antibody (clone AE1/AE3) Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | 53-9003-80 | Storage conditions: +4°C |
| Paraformaldehyde 16% | ThermoFisher | 11490570 | Fixation solution. Storage conditions: +4°C |
| PD-L1 monoclonal antibody (clone 29E2A3) – Phycoerythrin | BioLegend | BLE329706 | Storage conditions: +4°C |
| Petri Dish | Dutscher | 632180 | Storage conditions: Room temperature |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Ozyme | BE17-512F | Storage conditions: +4°C |
| Phosphate Buffered Saline Ultra Pure Grade 1X – 1L | 1st Base Laboratory | BUF-2040-1X1L | Storage conditions: Room temperature |
| Pluronic F-68 10% | Gibco | 24040-032 | Anti-binding solution. Storage conditions: Room temperature |
| Polylysine slides | ThermoFisher | J2800AMNZ | Storage conditions: Room temperature |
| Polypropylene Conical Tube 50 mL | Falcon | 352098 | Storage conditions: Room temperature |
| RBC Lysis Buffer – 100 mL | G Biosciences | 786-649 | Storage conditions: +4°C |
| RBC Lysis Buffer – 250 mL | G Biosciences | 786-650 | Storage conditions: +4°C |
| Resuspension Buffer (RSB) | Biolidics | CBB-F016003 | Storage conditions: +4°C |
| Shandon Cytopsin4 centrifuge | ThermoFisher | A78300003 | Dedicated centrifuge. Storage conditions: Room temperature |
| Silicon Isolator | Grace bio-Labs | 664270 | Storage conditions: Room temperature |
| Sterile Deionized Water – 100 mL | 1st Base Laboratory | CUS-4100-100ml | Storage conditions: Room temperature |
| Straight Fluorescent microscope Axio Imager D1 | Zeiss | Storage conditions: Room temperature | |
| Surgical Sterile Bag | SPS Laboratoires | 98ULT01240 | Storage conditions: Room temperature |
| Syringe BD Discardit II 20 mL sterile | BD Biosciences | 300296 | Storage conditions: Room temperature |
| Syringe Filter 0.22 µm 33 mm sterile | ClearLine | 51732 | Storage conditions: Room temperature |
| Zen lite 2.3 Lite Software | Zeiss | Microscope associated software |
References
- Gandhi, L., et al. Pembrolizumab plus Chemotherapy in Metastatic Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 378 (22), 2078-2092 (2018).
- Paz-Ares, L., et al. Pembrolizumab plus Chemotherapy for Squamous Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 379 (21), 2040-2051 (2018).
- Langer, C. J., et al. Carboplatin and pemetrexed with or without pembrolizumab for advanced, non-squamous non-small-cell lung cancer: a randomised, phase 2 cohort of the open-label KEYNOTE-021 study. The Lancet Oncology. 17 (11), 1497-1508 (2016).
- Hellmann, M. D., et al. Tumor Mutational Burden and Efficacy of Nivolumab Monotherapy and in Combination with Ipilimumab in Small-Cell Lung Cancer. Cancer Cell. 33 (5), 853-861 (2018).
- Chouaid, C., et al. Feasibility and clinical impact of re-biopsy in advanced non small-cell lung cancer: a prospective multicenter study in a real-world setting (GFPC study 12-01). Lung cancer. 86 (2), 170-173 (2014).
- Nosaki, K., et al. Re-biopsy status among non-small cell lung cancer patients in Japan: A retrospective study. Lung cancer. 101, 1-8 (2016).
- Uozu, S., et al. Feasibility of tissue re-biopsy in non-small cell lung cancers resistant to previous epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor therapies. BMC Pulmonary Medicine. 17 (1), 175 (2017).
- Kim, T. O., et al. Feasibility of re-biopsy and EGFR mutation analysis in patients with non-small cell lung cancer. Thoracic Cancer. 9 (7), 856-864 (2018).
- Nicolazzo, C., et al. Monitoring PD-L1 positive circulating tumor cells in non-small cell lung cancer patients treated with the PD-1 inhibitor Nivolumab. Scientific Reports. 6, 31726 (2016).
- Guibert, N., et al. PD-L1 expression in circulating tumor cells of advanced non-small cell lung cancer patients treated with nivolumab. Lung cancer. 120, 108-112 (2018).
- Wang, Y., et al. PD-L1 Expression in Circulating Tumor Cells Increases during Radio(chemo)therapy and Indicates Poor Prognosis in Non-small Cell Lung Cancer. Scientific Reports. 9 (1), 566 (2019).
- Hao, S. -. J., Wan, Y., Xia, Y. -. Q., Zou, X., Zheng, S. -. Y. Size-based separation methods of circulating tumor cells. Advanced Drug Delivery Reviews. 125, 3-20 (2018).
- Williams, A., Balic, M., Datar, R., Cote, R. Size-based enrichment technologies for CTC detection and characterization. Recent results in cancer research. Fortschritte der Krebsforschung. Progres dans les recherches sur le cancer. 195, 87-95 (2012).
- Garcia, J., et al. Profiling of Circulating Tumor DNA (ctDNA) in Plasma of non-small cell lung cancer (NSCLC) patients, Monitoring of EGFR p.T790M mutated allelic fraction using BEAMing Companion Assay and Evaluation in future application in mimicking Circulating Tumors Cells (mCTC). Cancer Medicine. , (2019).
- Garcia, J., et al. Evaluation of pre-analytical conditions and comparison of the performance of several digital PCR assays for the detection of major EGFR mutations in circulating DNA from non-small cell lung cancers: the CIRCAN_0 study. Oncotarget. 8 (50), 87980-87996 (2017).
- Lustberg, M. B., et al. Heterogeneous atypical cell populations are present in blood of metastatic breast cancer patients. Breast Cancer Research. 16 (2), 23 (2014).
- Ilie, M., et al. “Sentinel” circulating tumor cells allow early diagnosis of lung cancer in patients with chronic obstructive pulmonary disease. PLoS ONE. 9 (10), 111597 (2014).
- Khoo, B. L., et al. Clinical validation of an ultra high-throughput spiral microfluidics for the detection and enrichment of viable circulating tumor cells. PLoS ONE. 9 (7), 99409 (2014).
- Heymann, J. J., et al. PD-L1 expression in non-small cell lung carcinoma: Comparison among cytology, small biopsy, and surgical resection specimens. Cancer Cytopathology. 125 (12), 896-907 (2017).
- Biswas, A., et al. Clinical performance of endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration for assessing programmed death ligand-1 expression in nonsmall cell lung cancer. Diagnostic Cytopathology. 46 (5), 378-383 (2018).
- Buttner, R., et al. Programmed Death-Ligand 1 Immunohistochemistry Testing: A Review of Analytical Assays and Clinical Implementation in Non-Small-Cell Lung Cancer. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 35 (34), 3867-3876 (2017).
