एक उपन्यास Nicotinamide Adenine Dinucleotide सुधार विधि के लिए Intracellular Ca2 + माप के साथ Fura-2-एनालॉग लाइव सेल में
Summary
NADH और fura-2 एनालॉग की उत्तेजना और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य के वर्णक्रमीय ओवरलैपिंग के कारण, लाइव कोशिकाओं में दोनों रसायनों से संकेत हस्तक्षेप [Ca2 +] की मात्रात्मक माप के दौरान अपरिहार्य है। इस प्रकार, NADH संकेत हस्तक्षेप के एक उपन्यास ऑनलाइन सुधार विधि को मापने के लिए [Ca2 +] विकसित किया गया था.
Abstract
मापने के लिए [Ca2 +] मात्रात्मक, fura-2 एनालॉग, जो अनुपातमेट्रिक फ्लोरोप्रोब हैं, अक्सर उपयोग किया जाता है। हालांकि, डाई उपयोग आंतरिक रूप से autofluorscence हस्तक्षेप की वजह से जीना कोशिकाओं में सीमित है, मुख्य रूप से nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) से. अधिक विशेष रूप से, यह एक प्रमुख बाधा है जब mitochondrial को मापने [Ca2 +] मात्रात्मक रूप से fura-2 एनालॉग का उपयोग कर, क्योंकि NADH के बहुमत mitochondria में है. यदि फ्लोरोसेंट डाई एकाग्रता एक ही है, एक निश्चित उत्तेजना तीव्रता एक ही उत्सर्जन तीव्रता का उत्पादन करना चाहिए. अतः दो विभिन्न उत्तेजना तरंगदैर्ध्य का उत्सर्जन तीव्रता अनुपात स्थिर होना चाहिए। इस सिद्धांत के आधार पर, NADH संकेत हस्तक्षेप के एक उपन्यास ऑनलाइन सुधार विधि को मापने के लिए [Ca2 +] विकसित किया गया था, और NADH और fura-2 के वास्तविक संकेत तीव्रता प्राप्त किया जा सकता है. इसके अलावा, गणना करने के लिए एक उपन्यास समीकरण [Ca2 +] isosbestic उत्तेजना या 400 एनएम पर उत्तेजना के साथ विकसित किया गया था. इस विधि के साथ, माइटोकोंड्रियाल [सीए2+] में परिवर्तन सफलतापूर्वक मापा जा सकता है। इसके अलावा, उत्तेजना और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य के एक अलग सेट के साथ, कई पैरामीटर, NADH सहित, [Ca2 +], और पीएच या mitochondrial झिल्ली क्षमता (जेडएम),एक साथ मापा जा सकता है. माइटोकोंड्रियाल [सीए2+] और जेडएम या पीएच को फ्यूरा-2-एफएफ और टेट्रामेथिलहोडामाइन एथिल एथिल एस्टर (टीएमआरई) या कार्बोक्सी-सेमीनाफ्होरफ्लोर-1 (कार्बोक्सी-स्नेफ-1) का उपयोग करके मापा गया था।
Introduction
इंट्रासेल्यूलर कै2+ की महत्वपूर्ण भूमिका व्यापक रूप से जानी जाती है1. कोशिकीय शारीरिक प्रकार्यों की प्रक्रियाओं को समझने के लिए [Ca2+] का परिमाणीकरण आवश्यक है। Fura-2 एनालॉग काफी उपयोगी हैं क्योंकि वे यूवी रेंज में उत्साहित हैं (lt;400 एनएम), और अनुपातमेट्रिक विधि मात्रात्मक माप के लिए लागू किया जा सकता है. इसलिए, इस तरह के पीएच के रूप में अन्य शारीरिक मापदंडों, झिल्ली क्षमता, आदि, अन्य फ्लोरोसेंट रंगों के साथ मापा जा सकता है. माइटोकोंड्रियाल कै2+ सांद्रता ([Ca2+]उ) श्रेणी कथित तौर पर 0.08$20 $M2,3,4,5. Fura-2 एनालॉग के अलावा, fura-2-FF [Ca2 +] की इस सीमा को मापने के लिए उपयुक्त है। हालांकि, जीवित कोशिकाओं दुर्भाग्य से उनके चयापचय प्रक्रियाओं के लिए NADH/NADPH होते हैं, और NADH fura-2 एनालॉग के साथ ओवरलैपिंग उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रम की वजह से संकेत हस्तक्षेप उत्पन्न करता है। यह हस्तक्षेप बहुत fura-2 एनालॉग के उपयोग को सीमित करता है। विशेष रूप से, यदि एनालॉग mitochondrial को मापने के लिए लागू किया जाता है [Ca2 +], इस हस्तक्षेप सबसे बड़ी बाधा है क्योंकि NADH की सबसे अधिक राशि mitochondria में है. यह नाडाड परिवर्तनों से और जटिल है जो माइटोकोंड्रियाल झिल्ली की क्षमता(ज )से संबंधित है और$m का परिवर्तन [Ca2+]m6,7,8 , 9.इसके अतिरिक्त, [Ca2+]m गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए, अन्य माइटोकोंड्रियाल पैरामीटरों की स्थिति जानना आवश्यक है, जैसे नाड, $एम, और पीएच।
353 एनएम, 361 एनएम, और 400 एनएम पर उत्तेजना के साथ 450 एनएम और 500 एनएम पर उत्सर्जन में नाडाह और फ्यूरा-2-एफएफ के संकेत होते हैं, और समीकरण इस प्रकार हैं। इसमें, 353 एनएम और 361 एनएम क्रमशः 450 एनएम और 500 एनएम पर उत्सर्जन के लिए फ्यूरा-2-एफएफ के आइसोबेस्टिक अंक हैं।
F361,450 ] F361,450,NADH + F361,450,Fura समीकरण 1
F353,500 ] F353,500,NADH + F353,500,Fura समीकरण 2
F400,500 ] F400,500,NADH + F400,500,Fura समीकरण 3
जहां एफएक्स, y द्वारा y-nm पर मापा उत्सर्जन तीव्रता है x-nm उत्तेजना, एफएक्स, y, NADH शुद्ध NADH-निर्भर उत्सर्जन तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है, और एफएक्स,y,Fura शुद्ध fura-2-FF-निर्भर उत्सर्जन तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है। फ्लोरोसेंट डाई की एक ही एकाग्रता के तहत, एक निश्चित उत्तेजना तीव्रता एक ही उत्सर्जन तीव्रता का उत्पादन करना चाहिए. अतः दो विभिन्न उत्तेजना तरंगदैर्ध्य का उत्सर्जन तीव्रता अनुपात स्थिर होना चाहिए। Ca2+ और fura-2 NADH फ्लोरोसेंट विशेषताओं को प्रभावित नहीं किया; अतः 450 दउ पर उत्सर्जन का अनुपात तथा 500 दउ नाडड किसी भी उत्तेजना तरंगदैर्ध्य पर स्थिर था। एक ही नियम fura-2-FF के लिए इस धारणा के आधार पर इस्तेमाल किया जा सकता है कि NADH या [Ca2 +] fura-2-FF के उत्सर्जन और उत्तेजना स्पेक्ट्रम को प्रभावित नहीं करता है. हालांकि, Ca2 + fura-2-FF उत्सर्जन की एक वर्णक्रमीय बदलाव का कारण बना. इसलिए, Ca2 +के प्रभाव को दूर करने के लिए, isosbestic उत्तेजना, जो Ca2 +से स्वतंत्र है, का उपयोग करने की जरूरत है. प्रत्येक उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य (यानी, 450 एनएम और 500 एनएम) एक अलग isosbestic बिंदु है, और हमारे प्रयोगात्मक सेटअप से, 353 एनएम पर 500 एनएम और 361 एनएम पर 450 एनएम चुना गया. इन से, निम्नलिखित समीकरण मान्य हैं10.
आरएफ ] एफ361,450,Fura/F353,500,Fura समीकरण 4
आरएन 1 ] एफ400,500,NADH/F361,450,NADH समीकरण 5
आरएन 2 ] एफ353,500,NADH/F361,450,NADH समीकरण 6
इन स्थिरांकों के साथ, (समीकरण 1) (समीकरण 2) से निम्न समीकरण और (समीकरण 3) मान्य हैं।
F361,450 ] F361,450,NADH + Rf ] F353,500,Fura समीकरण 7
F353,450 ] RN2 ] F361,450,NADH + F353,500,Fura समीकरण 8
F400,500 ] RN1 ] F361,450,NADH + F400,500,Fura समीकरण 9
यदि तच,त्द1तथा त्द2 ज्ञात हों तो नाध तथा फरा-2 के शुद्ध संकेत निम्नानुसार प्राप्त किए जा सकते हैं।
F361,450,NADH ] (F361,450 – Rf ] F353,500)/
F353,500,Fura ] (RN2 ] F361,450 ] F353,500)/
F400,500,Fura ] F400,500 ] RN1 ] F361,450,NADH समीकरण 12
आरFura ] F353,500,Fura/ एफ400,500, Fura समीकरण 13
फरा-2-एफएफ का Ca2+-बाउंड रूप 400 एनएम उत्तेजना तरंगदैर्ध्य पर व्यावहारिक रूप से गैर-फ्लोरोसेंट था। इस गुण के आधार पर, निम्न नए अंशांकन समीकरण प्राप्त किया जा सकता है।
[Ca2+] Kd ] (F400,500,max/ F353,500,max) ] (RFura ] Rmin) समीकरण 14
जहां Kd एक वियोजन स्थिरांक है, F400,500, अधिकतम और F353,500, अधिकतम 400 एनएम और 353 एनएम पर उत्तेजना के साथ 500 एनएम पर उत्सर्जित संकेतों की अधिकतम मान रहे हैं, क्रमशः, और आरमिनट Ca 2 में न्यूनतम आरFura है +-मुक्त हालत। चूंकि isosbestic उत्तेजना का उपयोग किया गया था, समीकरण निम्नानुसार आगे सरल किया जा सकता है.
[Ca2+] Kd ] (1 / Rmin) ] (RFura ] Rmin) समीकरण 15
इसलिए, केवल Kd और Rमिनट मान [Ca2 +] की गणना करने के लिए आवश्यक हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
हस्तक्षेप सुधार विधि सफलतापूर्वक NADH और fura-2 एनालॉग के संकेतों को मापने के लिए विकसित किया गया था। सटीक सुधार के लिए संकेतों का सटीक माप आवश्यक है। हालांकि, फ्लोरोसेंट डिवाइस की अंतर्निहित प्रकृति एक पृष…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
विज्ञान, आईसीटी और भविष्य की योजना (NRF-2016M3C1A69606) के विज्ञान मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित कोरिया के राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन (एनआरएफ) के माध्यम से इस काम को आंशिक रूप से बुनियादी विज्ञान अनुसंधान कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था और व्यापार, उद्योग और ऊर्जा मंत्रालय (10068076) द्वारा.
Materials
| 2 mL eppendorf tube | Axygen | MCT-200-C | 2 mL Tube |
| AD/DA converter | Instrutech | ITC-18 | Equipment |
| ADP, Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate | Sigma-aldrich | A5285 | Chemicals |
| Band pass filter | Ealing Electro-Optics, Inc | 35-3920 | Equipment, 640±11nm |
| Band pass filter | Omega Optical | 690-9823 | Equipment, 590±15nm |
| Band pass filter | Omega Optical | 500DF20-9916 | Equipment, 500±20nm |
| Band pass filter | Chroma Technology Corp. | 60685 | Equipment, 450±30nm |
| Calcium chloride solution | Sigma-aldrich | 21114 | Chemicals |
| carboxy-SNARF-1(AM) | Invitrogen | C1272 | Chemicals |
| Charge-coupled device (CCD) camera | Philips | FTM1800NH/HGI | Equipment |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 86009 | Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : <400nm, 490±10, 560±10, Transmission : 460±15, 510±20, >580nm |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 567DCXRU | Equipment, Reflection : <560nm, Transmission : > 580 nm |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 480dclp | Equipment, Reflection : <470nm, Transmission : > 490 nm |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 20728 | Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : <405nm, 470±30, Transmission : 430nm~520nm, > 640 nm |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma-aldrich | 154938 | Chemicals |
| DMEM, Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Sigma-aldrich | D5030 | Chemicals |
| EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid | Sigma-aldrich | E4378 | Chemicals |
| FCCP, Mesoxalonitrile 4-trifluoromethoxyphenylhydrazone | Sigma-aldrich | 21857 | Chemicals |
| field diaphragm | Nikon | 86506 | Equipment |
| Fura-2-FF(AM) | TEFLABS | 137 | chemicals |
| Green tube | DWM | test tube | |
| HEPES, 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) | Sigma-aldrich | H3375 | Chemicals |
| High-speed counter | National Instruments | NI-6022 | Equipment |
| Hot mirror | Chroma Technology Corp. | 21002 | Equipment, 50:50 |
| Inverted microscope | Nikon | TE-300 | Equipment |
| Malate | Sigma-aldrich | 27606 | Chemicals |
| Near infrared filter | Chroma Technology Corp. | D750/100X | Equipment, 750±100nm |
| Oil immersion lens | Nikon | MRF01400 | 40x, NA 1.3; Equipment |
| Photon counter unit | Hamamatsu | C3866 | Equipment |
| Photon multiplier tube | Hamamatsu | R2949 | Equipment |
| Polychrome II | Till Photonics | SA3/MG04 | Equipment |
| Potassium chloride | Merck | 1.04936 | Chemicals |
| Potassium hydroxide solution | Sigma-aldrich | P4494 | Chemicals |
| Pyruvate | Sigma-aldrich | 107360 | Chemicals |
| Rotenone | Sigma-aldrich | R8875 | Chemicals |
| Saponin | Sigma-aldrich | S4521 | Chemicals |
| TMRE, Tetramethylrhodamine, ethyl ester | Molecular probes | T669 | Chemicals |
References
- Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).
- Miyata, H., et al. Measurement of mitochondrial free Ca2+ concentration in living single rat cardiac myocytes. American Journal of Physiology. 261 (4 Pt 2), H1123-H1134 (1991).
- Allen, S. P., Stone, D., McCormack, J. G. The loading of fura-2 into mitochondria in the intact perfused rat heart and its use to estimate matrix Ca2+ under various conditions. Journal of Molecular Cellular Cardiology. 24 (7), 765-773 (1992).
- Griffiths, E. J., Halestrap, A. P. Pyrophosphate metabolism in the perfused heart and isolated heart mitochondria and its role in regulation of mitochondrial function by calcium. Biochemical Journal. 290 (Pt 2), 489-495 (1993).
- Crompton, M., Moser, R., Ludi, H., Carafoli, E. The interrelations between the transport of sodium and calcium in mitochondria of various mammalian tissues. European Journal of Biochemistry. 82 (1), 25-31 (1978).
- Chance, B., Schoener, B., Oshino, R., Itshak, F., Nakase, Y. Oxidation-reduction ratio studies of mitochondria in freeze-trapped samples. NADH and flavoprotein fluorescence signals. The Journal of Biological Chemistry. 254 (11), 4764-4771 (1979).
- Eng, J., Lynch, R. M., Balaban, R. S. Nicotinamide adenine dinucleotide fluorescence spectroscopy and imaging of isolated cardiac myocytes. Biophysical Journal. 55 (4), 621-630 (1989).
- Brandes, R., Bers, D. M. Simultaneous measurements of mitochondrial NADH and Ca(2+) during increased work in intact rat heart trabeculae. Biophysical Journal. 83 (2), 587-604 (2002).
- Jo, H., Noma, A., Matsuoka, S. Calcium-mediated coupling between mitochondrial substrate dehydrogenation and cardiac workload in single guinea-pig ventricular myocytes. Journal of Molecular Cellular Cardiology. 40 (3), 394-404 (2006).
- Lee, J. H., Ha, J. M., Leem, C. H. A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Mitochondrial Ca2+ Measurement with FURA-2-FF in Single Permeabilized Ventricular Myocytes of Rat. Korean Journal of Physiology and Pharmacology. 19 (4), 373-382 (2015).
- Powell, T., Terrar, D. A., Twist, V. W. Electrical properties of individual cells isolated from adult rat ventricular myocardium. Journal of Physiology. 302, 131-153 (1980).
- Sun, B., Leem, C. H., Vaughan-Jones, R. D. Novel chloride-dependent acid loader in the guinea-pig ventricular myocyte: part of a dual acid-loading mechanism. Journal of Physiology. 495 (Pt 1), 65-82 (1996).
- Page, E. Quantitative ultrastructural analysis in cardiac membrane physiology. American Journal of Physiology. 235 (5), C147-C158 (1978).
- Page, E., McCallister, L. P., Power, B. Sterological measurements of cardiac ultrastructures implicated in excitation-contraction coupling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (7), 1465-1466 (1971).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
