Interaksjoner med og membran Permeabilization av Brain mitokondrier av amyloid fibrils

Summary

Forutsatt her er en protokoll for å undersøke samspillet mellom innfødte form, prefibrillar, og modne amyloid fibrils av ulike peptider og proteiner med mitokondrier isolert fra ulike vev og ulike områder av hjernen.

Abstract

En økende mengde bevis indikerer at membran permeabilization, inkludert interne membraner som mitokondrier, er en vanlig funksjon og primær mekanisme av amyloid aggregat-indusert toksisitet i nevrodegenerative sykdommer. Men de fleste rapporter som beskriver mekanismene for membran avbrudd er basert på fosfolipid modellsystemer, og studier direkte målretting hendelser forekommende på nivået av biologiske membraner er sjeldne. Beskrevet her er en modell for å studere mekanismene for amyloid toksisitet på membran nivå. For mitokondrie isolasjon brukes tetthet gradient medium for å oppnå forberedelser med minimal myelin forurensning. Etter mitokondrie membran integritet bekreftelse, er samspillet av amyloid fibrils som følge av α-synuclein, storfe insulin, og høne eggehvite lysozyme (HEWL) med rotte hjernen mitokondrier, som en in vitro biologisk modell, er undersøkt. Resultatene viser at behandling av hjernen mitokondrier med fibrillær forsamlinger kan føre til ulike grader av membran permeabilization og ROS innhold ekstrautstyr. Dette indikerer struktur avhengige interaksjoner mellom amyloid fibrils og mitokondrie membran. Det er antydet at Biofysiske egenskaper av amyloid fibrils og deres spesifikke binding til mitokondrie membraner kan gi forklaringer for noen av disse observasjonene.

Introduction

Amyloid-relaterte lidelser, kjent som amyloidoses, utgjør en stor gruppe sykdommer definert ved utseendet av uløselig protein avleiringer i ulike vev og organer^1,2. Blant dem, nevrodegenerative lidelser er de hyppigst formene der protein aggregater vises i den sentrale eller perifere nervesystemet². Selv om en rekke mekanismer har blitt foreslått å være involvert i toksisitet av amyloid aggregater³, en økende mengde bevis peker til celle membran avbrudd og permeabilization som den primære mekanismen for amyloid patologi^{4, fem}på. I tillegg til plasma membran, kan indre organeller (dvs. mitokondrier) også bli påvirket.

Interessant, tyder nye bevis på at mitokondrie dysfunksjon spiller en avgjørende rolle i patogenesen av nevrodegenerative lidelser, inkludert Alzheimers og Parkinsons sykdommer^6,7. I samsvar med dette problemet har mange rapporter indikert binding og akkumulering av amyloid β-peptid, α-synuclein, Huntingtin og ALS-tilknyttede mutant SOD1 proteiner til mitokondrier^{8,9,10, 11}. mekanismen av membran permeabilization av amyloid aggregater antas å forekomme enten gjennom dannelse av diskrete kanaler (porer) og/eller gjennom en uspesifisert vaskemiddel-lignende mekanisme^{5,12, 13 i år}. Det er bemerkelsesverdig at de fleste av disse konklusjonene har vært basert på rapporter som involverer fosfolipid modellsystemer, og studier direkte rettet mot hendelser som forekommer i biologiske membraner er sjeldne. Åpenbart, disse kunstige lipid bilayers ikke nødvendigvis gjenspeiler de iboende egenskapene til biologiske membraner, inkludert de av mitokondrier, som er heterogene strukturer og sammensatt av et bredt utvalg av fosfolipider og proteiner.

I denne studien, mitokondrier isolert fra rotte hjerner brukes som en in vitro biologisk modell for å undersøke de destruktive virkningene av amyloid fibrils som følge av α-synuclein (som en amyloidogenic protein), storfe insulin (som en modell peptid viser betydelig strukturell homologi med humant insulin involvert i injeksjon-lokaliserte amyloidose), og høne eggehvite lysozyme (HEWL; som en felles modell protein for studie av amyloid aggregering). Interaksjoner og mulige skader av mitokondrie membraner indusert av amyloid fibrils blir deretter undersøkt ved å observere utgivelsen av mitokondrie Malate dehydrogenase (MDH) (ligger i mitokondrie matrise) og mitokondrier reaktive oksygen arter (ROS) ekstrautstyr.

Protocol

Alle dyr eksperimenter ble utført i samsvar med institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) av Medical Sciences i Teheran universitetet. Maksimal innsats ble gjort for å minimere lidelse og skadelige effekter på rottene ved å skjerpe giljotinen kniver og bruke bestemt og raske bevegelser av bladet. 1. Brain homogenisering og mitokondrie isolasjon Merk: alle reagenser for mitokondrie isolasjon ble klargjort i henhold til Sims og Anderson1…

Representative Results

Protokollen beskriver en modell for å studere interaksjoner av amyloid fibril med rotte hjernen mitokondrier som en in vitro biologiske modell. For mitokondrie forberedelser, 15% (v/v) tetthet gradient medium ble brukt til å fjerne myelin som stor forurensning av hjernevevet14. Som vist i figur 1a, sentrifugering på 30 700 x g produserte to forskjellige band av materiale, myelin (som hovedkomponenten i band 1) og band …

Discussion

Et vell av eksperimentelle resultater støtter hypotesen om at cytotoksisitet av fibrillær aggregater er betydelig assosiert med deres evne til å samhandle med og permeabilize biologiske membraner^4,5. Men de fleste av dataene er basert på kunstige lipid bilayers som ikke nødvendigvis reflekterer de iboende egenskapene til biologiske membraner, som er heterogene strukturer med et bredt utvalg av fosfolipider og proteiner. Her, ved hjelp av hjernen mitokondrier…

Materials

2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate	Sigma	35845
Ammonium sulfate	Merck	1012171000
Black 96-well plate	Corning
Black Clear-bottomed 96-well plate	Corning
Bovine insulin	Sigma	I6634
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A2153
BSA essentially fatty acid-free	Sigma	A6003
Centrifuge	Sigma
Crystal clear sealing tape	Corning
CuSO4	Sigma	451657
Dialysis bag (cut off 2 KDa)	Sigma	D2272
Dounce homogenizer	Potter Elvehjem
EDTA	Sigma	E9884
Fluorescence plate reader	BioTek
Fluorescence spectrophotometer	Cary Eclipse VARIAN
Folin	Merck	F9252
Glycine	Sigma	G7126
Guillotine	Made in Iran
HCl	Merck	H1758
Hen Egg White Lysozyme (HEWL)	Sigma	L6876
Na2CO3	Sigma	S7795
NaH2PO4	Sigma	S7907
NaOH	Merck	S8045
Oxaloacetate	Sigma	O4126
Percoll	GE Healthcare
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Sigma	CS0030
PMSF	Sigma	P7626
Potassium sodium tartrate	Sigma	217255
Quartz cuvette	Sigma
Spectrophotometer	analytik jena	SPEKOL 2000 model
Succinate	Sigma	S2378
Sucrose	Merck	1076871000
Thermomixer	Eppendorph
Thioflavin T	Sigma	T3516
Tris-HCl	Merck	1082191000
Triton X-100	Sigma	T9284
Tryptone	QUELAB
Water bath	Memmert
Yeast Extract	QUELAB
β-NADH	Sigma	N8129