Forutsatt her er en protokoll for å undersøke samspillet mellom innfødte form, prefibrillar, og modne amyloid fibrils av ulike peptider og proteiner med mitokondrier isolert fra ulike vev og ulike områder av hjernen.
En økende mengde bevis indikerer at membran permeabilization, inkludert interne membraner som mitokondrier, er en vanlig funksjon og primær mekanisme av amyloid aggregat-indusert toksisitet i nevrodegenerative sykdommer. Men de fleste rapporter som beskriver mekanismene for membran avbrudd er basert på fosfolipid modellsystemer, og studier direkte målretting hendelser forekommende på nivået av biologiske membraner er sjeldne. Beskrevet her er en modell for å studere mekanismene for amyloid toksisitet på membran nivå. For mitokondrie isolasjon brukes tetthet gradient medium for å oppnå forberedelser med minimal myelin forurensning. Etter mitokondrie membran integritet bekreftelse, er samspillet av amyloid fibrils som følge av α-synuclein, storfe insulin, og høne eggehvite lysozyme (HEWL) med rotte hjernen mitokondrier, som en in vitro biologisk modell, er undersøkt. Resultatene viser at behandling av hjernen mitokondrier med fibrillær forsamlinger kan føre til ulike grader av membran permeabilization og ROS innhold ekstrautstyr. Dette indikerer struktur avhengige interaksjoner mellom amyloid fibrils og mitokondrie membran. Det er antydet at Biofysiske egenskaper av amyloid fibrils og deres spesifikke binding til mitokondrie membraner kan gi forklaringer for noen av disse observasjonene.
Amyloid-relaterte lidelser, kjent som amyloidoses, utgjør en stor gruppe sykdommer definert ved utseendet av uløselig protein avleiringer i ulike vev og organer1,2. Blant dem, nevrodegenerative lidelser er de hyppigst formene der protein aggregater vises i den sentrale eller perifere nervesystemet2. Selv om en rekke mekanismer har blitt foreslått å være involvert i toksisitet av amyloid aggregater3, en økende mengde bevis peker til celle membran avbrudd og permeabilization som den primære mekanismen for amyloid patologi4, fempå. I tillegg til plasma membran, kan indre organeller (dvs. mitokondrier) også bli påvirket.
Interessant, tyder nye bevis på at mitokondrie dysfunksjon spiller en avgjørende rolle i patogenesen av nevrodegenerative lidelser, inkludert Alzheimers og Parkinsons sykdommer6,7. I samsvar med dette problemet har mange rapporter indikert binding og akkumulering av amyloid β-peptid, α-synuclein, Huntingtin og ALS-tilknyttede mutant SOD1 proteiner til mitokondrier8,9,10, 11. mekanismen av membran permeabilization av amyloid aggregater antas å forekomme enten gjennom dannelse av diskrete kanaler (porer) og/eller gjennom en uspesifisert vaskemiddel-lignende mekanisme5,12, 13 i år. Det er bemerkelsesverdig at de fleste av disse konklusjonene har vært basert på rapporter som involverer fosfolipid modellsystemer, og studier direkte rettet mot hendelser som forekommer i biologiske membraner er sjeldne. Åpenbart, disse kunstige lipid bilayers ikke nødvendigvis gjenspeiler de iboende egenskapene til biologiske membraner, inkludert de av mitokondrier, som er heterogene strukturer og sammensatt av et bredt utvalg av fosfolipider og proteiner.
I denne studien, mitokondrier isolert fra rotte hjerner brukes som en in vitro biologisk modell for å undersøke de destruktive virkningene av amyloid fibrils som følge av α-synuclein (som en amyloidogenic protein), storfe insulin (som en modell peptid viser betydelig strukturell homologi med humant insulin involvert i injeksjon-lokaliserte amyloidose), og høne eggehvite lysozyme (HEWL; som en felles modell protein for studie av amyloid aggregering). Interaksjoner og mulige skader av mitokondrie membraner indusert av amyloid fibrils blir deretter undersøkt ved å observere utgivelsen av mitokondrie Malate dehydrogenase (MDH) (ligger i mitokondrie matrise) og mitokondrier reaktive oksygen arter (ROS) ekstrautstyr.
Et vell av eksperimentelle resultater støtter hypotesen om at cytotoksisitet av fibrillær aggregater er betydelig assosiert med deres evne til å samhandle med og permeabilize biologiske membraner4,5. Men de fleste av dataene er basert på kunstige lipid bilayers som ikke nødvendigvis reflekterer de iboende egenskapene til biologiske membraner, som er heterogene strukturer med et bredt utvalg av fosfolipider og proteiner. Her, ved hjelp av hjernen mitokondrier…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Forskningsrådet for Institutt for avanserte studier i Basic Sciences (IASBS), Zanjan, Iran.
2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate | Sigma | 35845 | |
Ammonium sulfate | Merck | 1012171000 | |
Black 96-well plate | Corning | ||
Black Clear-bottomed 96-well plate | Corning | ||
Bovine insulin | Sigma | I6634 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
BSA essentially fatty acid-free | Sigma | A6003 | |
Centrifuge | Sigma | ||
Crystal clear sealing tape | Corning | ||
CuSO4 | Sigma | 451657 | |
Dialysis bag (cut off 2 KDa) | Sigma | D2272 | |
Dounce homogenizer | Potter Elvehjem | ||
EDTA | Sigma | E9884 | |
Fluorescence plate reader | BioTek | ||
Fluorescence spectrophotometer | Cary Eclipse VARIAN | ||
Folin | Merck | F9252 | |
Glycine | Sigma | G7126 | |
Guillotine | Made in Iran | ||
HCl | Merck | H1758 | |
Hen Egg White Lysozyme (HEWL) | Sigma | L6876 | |
Na2CO3 | Sigma | S7795 | |
NaH2PO4 | Sigma | S7907 | |
NaOH | Merck | S8045 | |
Oxaloacetate | Sigma | O4126 | |
Percoll | GE Healthcare | ||
Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma | CS0030 | |
PMSF | Sigma | P7626 | |
Potassium sodium tartrate | Sigma | 217255 | |
Quartz cuvette | Sigma | ||
Spectrophotometer | analytik jena | SPEKOL 2000 model | |
Succinate | Sigma | S2378 | |
Sucrose | Merck | 1076871000 | |
Thermomixer | Eppendorph | ||
Thioflavin T | Sigma | T3516 | |
Tris-HCl | Merck | 1082191000 | |
Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
Tryptone | QUELAB | ||
Water bath | Memmert | ||
Yeast Extract | QUELAB | ||
β-NADH | Sigma | N8129 |