אנו מתארים שיטה להכנת התאים בודדים טרי שרירים מבודדים או חלקה מתוך דגימות שלפוחית השתן של האדם העסקת שני צעדים הליך אנזימטי. תאים DSM שהתקבלו קיימא ניתן ללמוד על ידי שונים שיטות תא בודד כולל המתואר אמפוריטיצין-B תיקון מלחציים אלקטרופיזיולוגיה כדי לחשוף תכונות פיזיולוגיות ופרמקולוגית.
תאים שריר החלקה (DSM) הנמצאים בתוך הקיר שלפוחית השתן בסופו של דבר להקל על אחסון שתן והווצמה. הכנת תאי ה-DSM הניתנים, הטריים והמבודדים, מציגה אתגר טכני חשוב שההישג שלהם מספק תאים אופטימליים למחקרים פונקציונליים ומולקולריים נוספים. השיטה פותחה ופירט בזאת, בהצלחה בשימוש על ידי הקבוצה שלנו למעלה מעשור, מתאר את הניתוח של דגימות השתן האנושי האדם שהתקבלו ניתוחים שלפוחית משתן לאחר מכן טיפול בשני השלבים אנזימטי של חתיכות dsm ו נשחקו מכני כדי לקבל תאים מבודדים של dsm טרי. הצעד הראשון כרוך בניתוח כדי להפריד בין שכבת ה-DSM (המוכרת גם בשם מוסקולאריס) מרירית (אורוטאלינום, לאמינה קינאה, ורירית מוסקולריס) והרקמות החיבור, כלי הדם והאדיפוז הסמוכות. ה-DSM נחתך לחתיכות (2-3 מ”מ x 4-6 מ”מ) ב-Ca הנומינלי2 +המכיל פתרון לניתוח/עיכול (DS). חתיכות DSM מועברים בשלב הבא ומטופלים באופן רציף בנפרד עם DS המכיל פפאין ו-כולגנאז ב ~ 37 ° צ’ צלזיוס עבור 30-45 דקות לכל שלב. בעקבות שוטף עם DS המכיל סרום ללא אנזים ומשולש עם מצננת אש מלוטשת, החלקים משחררים תאי DSM בודדים. תאי ה-DSM הבודדים מתאימים באופן אידיאלי לגבי מהדק-מלחציים ולמאפיינים פרמקלוגיים של ערוצי יונים. באופן ספציפי, אנו מראים כי TRPM4 channel חוסם 9-פניל מפחית זרמים מתח המסלול המתעלה הקליט עם הגישה אמפוריטיצין-B מחורר טלאי להתקרב. תאים DSM יכולים להיות גם ללמוד על ידי טכניקות אחרות כגון תא יחיד RT-PCR, ניתוח microarray, אימונוציטוטוכימיה, בסמיכות באתרו הקירבה, ו-Ca2 + הדמיה. היתרון העיקרי של ניצול תאי DSM יחיד הוא שתצפיות שנעשו מתייחסות ישירות מאפייני תא בודד נחשף. מחקרים של תאי ה-DSM הבודדים הטריים סיפקו תובנות חשובות המאפיינים את המאפיינים של ערוצי יונים שונים כולל לקטבת בשלפוחית השתן ותמשיך כתקן זהב בהסבר למאפייני הסלולר של DSM ומנגנוני רגולציה.
תאים השריר החלקה (DSM) מהווים את סוג התא הנפוץ ביותר בשלפוחית השתן ובסופו של דבר שליטה בשתן אחסון והשרירים דרך הרפיה והתכווצות, בהתאמה. תאים DSM טופס שריר החלקה צרורות השילוב עם רקמת חיבור סמוכים, תהליכי עצב, תאים ביניים, סוגי תאים אחרים1. ההבנה הנוכחית של התפקיד של תאי DSM בתפקוד שלפוחית השתן הושגה באמצעות גישה משולבת מרובת רמות. כל שיטה ניסיונית-בין אם מבוסס על תאים יחידים בודדים בתוך מבחנה, רצועות רקמה המכילות שריר החלקה צרורות בחוץ-גופית/ex vivo, או ב vivo דטרמיניזם (כגון cy try והערכות פונקציה ההיגוי)- מספק תובנות חשובות וספציפיות לתוך תכונות פיזיולוגיות ופרמקולוגית של DSM (ראה ביקורות1,2,3,4 עם זאת, פרשנות של תוצאות שהתקבלו תאים בודדים בודדים מאפשר מסקנות במיוחד לייחס את סוג התא בודד עצמו. הבנה זו הייתה הכוח המניע להקמת שיטה אמינה ובעלת שימוש לגילוי לקבלת תאים מבודדים של ה-DSM מפני כל דגימות שלפוחית השתן הכוללת. שלא כמו סוגים רבים של תאים אחרים, תאים שריר החלקה לא יכול להיות תרבותי באופן אמין עקב אובדן של שלהם פנוטיפ הילידים כולל שינויים ספציפיים ב-electroפיסיולוגית שלהם נכסים7,8. עובדה זו מחזקת יותר את החשיבות של מחקרים שבוצעו בתאי DSM מבודדים מבחינה פיזיולוגית.
בשלהי שנות השמונים ותחילת שנות התשעים, הקבוצה של אידנברג (גרמניה) פרסמה סדרה של מחקרים אלקטרופיסיולוגיים על תאי DSM מבודדים טריים שהתקבלו מפני שלפוחיות שתן של חזיר מגינאה9,10,11,12,13 (שולחן 1). השיטה הדגישה שני תצפיות חשובות שסייעו בהשגת תאים חיוניים ושימשה כהנחיה ראשונית לאחרים. הם היו 1) טיפול מקדים בחתיכות DSM מבודדים עם Ca2 +-פתרון חינם/בינוני לפני טיפול אנזימטי ו 2) העיכול רקמות עם פתרון המכיל את הקולגן. שני צעדים קריטיים אלה שולבו בכל הגרסאות העוקבות של הליכי דיסוציאציה של תא DSM (שולחן 1). כיום, הקבוצה שלנו מעסיקה שניים שלבים רציפים papain הגישה לדיסוציאציה. חתיכות DSM מטופלים לראשונה עם פתרון אנזים המכיל פפאין ולאחר מכן עם הקולגן סוג II מסיסות באותו פתרון (DS, ניתוח/עיכול פתרון). גישה זו מניבה תאי DSM בודדים ממינים שונים, כולל שפן ניסיונות, חזיר, חולדה, עכבר, וחשוב ביותר (שולחן 1).
תאי DSM בודדים מספקים מקור לביולוגיה מולקולרית מספר ניסויים פיזיולוגיים. עד כה, ביטויי חלבון ו-mRNA למדו באמצעות האימונוציטוכימיה, או בדיקות ה-RT-PCR/רביעיית-PCR התגלו רמות גבוהות של גילוי עבור ערוצי יונים שונים, כולל מתח מוליכות גדול-ו-Ca2 +מופעל (BK), מוליכות קטנה ca2 +-הופעל k+ סוג 3 (SK3), מגודרת מתח k+ (kv), L-סוג מגודרת מתח Ca2 + (Cav), ו קולטן ארעי הפוטנציאל מסוג 4 (TRPM4) ערוצים, כמו גם Na/Ca2 + מחליף 14,15,16,17,18,19,20,21,22. הם כולם חשבו לשלוט על היכולת של ה-DSM, התאיים על2 + רמות והקונקטיליות. תיקון-קלאמפ גישות פיסיולוגיים, שבוצעו ישירות על חזיר גינאה, עכבר, עכברוש, או תאים DSM האדם, סיפק הפגנה ישירה של תכונות ביופיזיקלי ו פרמקולוגית של L-סוג Cav, kv (kv2. x. Kv7), SK, BK, ו TRPM4 ערוצים17,19,20,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30,31. הגישות כללו מלחציים בעלי מתח פנימי רגיל, מלחציים מחוררים ומצמד מתח מחורר, והקלטות של ערוץ יחיד (מצורפות תא, הפנים-החוצה ותצורות חיצוניות). בנוסף, הקלטה פוטנציאלית הממברנה של DSM באמצעות מלחציים הנוכחי סיפק ראיות כי היעד מרתק סוכנים תרופתי לשנות את היכולת של הסלולר. לדוגמה, TRPM4 מעכב 9-פנילאני המושרה היפרפולריזציה בתאי DSM שהתקבלו בני אדם, שפן גינאה, ו עכברוש שלפוחיות שתןשככים19,20,22,31. בין שיטות אלקטרופיזיולוגיות שונות, אמפוריטיצין-B (ו nystatin, מגרסידין, ו β-escin) מחורר הקלטות תיקון-קלאמפ לספק יתרון מפתח על ידי שמירה על מולקולות איתות מהותי תאיים ומסלולים. רק משקל מולקולרי נמוך הקטרים במידה פחותה, קלרנית– -אבל לא חלבונים או מולקולות איתות כולל Ca2 + -הם חדיר דרך נקבוביות קרום הפלזמה נוצר על ידי אמפוריטיצין-B או nystatin32. התוצאה המוצלחת של ניסויים מחורר מלחציים טלאי תלוי במספר משתנים כלליים ייחודי לטכניקה זו. כאן, אנו מתארים את פרטי ההליך ניצול אמפוריטיצין-B כי הקבוצה שלנו השתמשה בהצלחה במהלך השנים15,22,33,34,35,36,37,38,39.
לטעון, ערוצי הקטיון שאינם סלקטיבית נותרים אחד מסוגי הערוצים הפחות מובנים בתאי DSM. הדוח הראשון של ערוץ היון שאינו סלקטיבי מתאריך חזרה ל1993. המאמר על ידי ולנר וישראנברג11 תיאר 33 pS ערוץ יחיד המופעל למתוח המציג את סדר הדירוג הבא של חדירות היונים: K+> Na+>Cs+> > > Ba2 +> Ca2 +, ועיכוב של פעילות ערוץ על ידי Gd3 +, מעכב כללי של ערוצי קטיון לא סלקטיבית. כמעט עשור לאחר מכן, Thorneloe ו נלסון40 תיאר Na+ לחדיר זרמים היון בתאי DSM העכבר, מעוכבים על ידי Gd3 +, באמצעות הקלטות התאים השלם. מאז הזהויות המולקולריות של ערוצי הקטיון הבלתי-סלקטיבית והמאפיינים הביופיסיים שלהם נותרים, יש לקבוע חקירות עתידיות באזור מחקר זה. הפרוטוקול המתואר בזאת להקלטה של זרמים בערוץ הקטיון לא סלקטיבי-באמצעות מסחטות ומוצרים תאיים המכילים פתרונות מבוססי Cs+, תה+, ו nifedipine (שולחן 2) כי הטיה מבחינה פיזיולוגית ופרמקולוגית Kv ו-Cav והוא ימשיך להיות שימושי בחקירות אלקטרופיזיולוגיות של ערוצי היון לא סלקטיבי יש לנו מנוצל זה פרוטוקול ספציפי כדי לקבוע את היקף העיכוב של זרמי הקטיון של תא שלם על ידי TRPM4 channel חוסם 9-פנילl בפיג שפן, עכברוש ותאי DSM האדם19,20,22.
ביחד, השיטה המתוארת כאן לקבלת תאים מבודדים בודד DSM מתוך שלפוחית השתן האנושית מספק תאים קיימא מתאים מאוד לחקירות אלקטרופיזיולוגיות באמצעות תצורות שונות של טכניקת התיקון-קלאמפ, Ca2 +-הדמיה, אימונוציטוטוכימיה, בתוך שיטת הליטיגציה האבובית באתרו, ואת תא בודד RT-Pcr/רביעיית-PCR, כמו גם טכניקות מתקדמות בביולוגיה מולקולרית כולל ניתוח MICROARRAY, RNA-seq, ו-שבב-seq. השימוש בשיטת התיקון האמפוריטיצין-B המחריב משמר את סביבת התא המקורי בניגוד לתצורות אחרות. כאשר בוצעו באמצעות התנאים הספציפיים המפורטים כאן, נועד לשלול את התרומות של K+ ו-Ca2 + זרמים בתאי DSM, זרמים המושרה בשלב המתח להציג את המאפיינים של זרמים היון לא סלקטיבי מתאים לביופיסיים ו פרמקולוגית.
ההליכים המתוארים כאן להסביר את השלבים המעורבים בהכנת התאים הקיימא, מבודדים בתאי DSM מעובי שלמות האדם דגימות שלפוחית השתן באמצעות העיכול אנזימטי ובהקלטה של זרמים שלמים תא היון רגיש לTRPM4 channel מעכב 9-פנילl העסקת אמפוריטיצין-B מחורר תיקון מהדק הגישה. ההליך האנזימטי מסתמך על חשיפה דו-שיטית בעלת שני שלבים המכונה בזאת כשיטת העיכול הרציפה. הרקמות DSM מטופלים לראשונה עם פפאין ו dithioitol (מייצב החומר האנזים) תחת Ca הנומינלי2 +-מצב חופשי, ואחריו בשלב השני על ידי הקולגן סוג II בנוכחות נמוכה Ca2 +. הרציונל לביצוע עיכול פפאין תחת נמוך Ca2 + התנאים בתאי שריר חלקה תאריכים בחזרה לסוף שנות השמונים. מבודד העורק הראשי מבודדים התאים השריר חלקה הכינה עם פפאין מוצג צורה מוארך, הראה הכדאיות (התנגדות ספיגת כחול טריטן) והגיבו גירויים הקונקטילה (Ca גבוהה יותר2 + ו היסטמין)65. שנים מאוחר יותר, שיטה זו הוחלה בהכנת תאי DSM (ראה טבלה 1). הבחירה של מסוג הספר השני במקום סוגים אחרים מתייחס הפעילות הפרוטחרדה שלה גבוה יחסית מתאים באופן אידיאלי רקמות שרירים חלקות כולל DSM. אכן, הטיפול בקולגן בלבד יכול להניב תאים DSM יחיד, אם כי דורש חשיפה אנזים נרחב (≥ 60 min)53,54. מאז הפעילות הקולגנאז תלויה ב-Ca2 + והאנזים אינו פעיל בתנאים של ca2 +-free, העיכול האנזימטי האופטימלי של חתיכות DSM דורש את הנוכחות של Ca2 + 66. במקרה שלנו, DS-C מכיל 100-200 μM [Ca2 +] (טבלה 2). לאחר טיפול אנזימטי, חתיכות DSM מתעכל שוטפים בעדינות מספר פעמים עם DS קר ללא אנזימים או Ca2 + כדי להסיר את כל האנזים המאוגד רקמות. התקררות הקרח מסייעת לשמר את שלמות התא של DSM ולהגביל את הפעילות האנזימטית של כל פפאין או הקולגן שנותרו. בשלב האחרון, נשחקו של חתיכות DSM שטופלו באנזימים עם אש מלוטשת מבריק פסטר משחרר תא DSM יחיד. תאי DSM ממוקמים מיד על תא הקלטה עבור לימודי תיקון או סוגים אחרים של ניסויים או מאוחסנים על קרח ב-DS לשימוש מאוחר יותר באותו יום (בדרך כלל בתוך 8 שעות של הכנה, אבל התאים נשארים קיימא עד 24 h).
זיהינו מספר שיקולים חשובים להשגת בהצלחה תאי DSM בודדים. הראשון מתייחס לאיכות המקור. של הדגימה האנושית של ה-DSM כדי לשמר בצורה אופטימלית את שלמות הרקמה, דגימות DSM שהתקבלו מניתוחי שלפוחית השתן הפתוחה ממוקמים DS קר קרח בהקדם האפשרי ומתוחזק בסביבה קרה. באופן ספציפי, על החילוץ כירורגי של המטופל, הדגימה שלפוחית השתן ממוקם מיד על שולחן צדדי מוכן בחדר הניתוח. בדיקה ברוטו של הדגימה כולה (מושגת בדרך כלל במהלך כריתת cystectomy קיצונית או פשוטה) והפתיחה שלה. לאחר בדיקה חזותית, פיסת עובי שלמות סולם השתן מוסר מאזור מרוחק של הדגימה מאוד לא מעורב עם הגידול ממוקם מיד לתוך ספל (או 50 או 100 mL) המכילים קר (~ 4 ° c) פתרון חיתוך (DS) (טבלה 2) ולאחר מכן סגור היטב עם מכסה. בשל האופי המתוכנן של קצירת הרקמה, אנשי חדר הניתוח וצוות העזר שעושים את הקציר מוזהרים בתחילת המקרה הכירורגי על מנת לקבל את החומרים הזמינים בחדר הניתוח בזמן הפקת הרקמה. אמצעי זהירות אלה יחד עם האופי השגרתי והחוזר של שלבי העיבוד לשמור על הזמן החמים איסכמיה עבור הרקמה-מן החילוץ למיקום במיכל מקורר עם פתרון DS-כדי פחות מ 5 דקות. המיכל ממוקם לאחר מכן במקרר או בקרח בצידנית כדי לשמור על הסביבה הקרה ומועבר (קר בקרח) למעבדה. ברגע שהוא מגיע למעבדה, מתחילים לבצע את צעדי הדיסוציאציה. קשה מאוד לנבא אם מדגם DSM מסוים יניב תאי DSM באיכות גבוהה בעקבות דיסוציאציה אנזימטית, ולכן נמשיך בצעדי הדיסוציאציה האנזימטיים. במקרים רבים, במקביל לניסויים אלקטרולוגיים, הקבוצה שלנו מבצעת הקלטות מתח שונות על רצועות DSM המוכנות מאותם דגימות DSM. גילינו כי בדרך כלל אנו יכולים להשיג תאים DSM באיכות גבוהה מן ההכנות כי גם לספק בהצלחה רצועות קיימא עבור לימודי התכווצות איזומטרי (ההתבוננות שלא פורסמה שלנו).
הגורם השני מתייחס ליכולות שונות של אנזימים. הבחנו כי עבור שניהם פפאין ו כולקולאז סוג II, בכל פעם הרבה חדש של אנזים מגיע הספק, פעילות האנזים DS עבור העיכול רקמות יכול להשתנות. אנו, לפיכך, לייעל באופן שגרתי את ריכוז האנזים ואת מרווחי דגירה עבור כל הרבה חדש. כדי למזער את התרומה הרבה להשתנות, אנו מסודרים כמויות גדולות יותר של אותו הרבה ולעשות אצווה גדולה של פתרונות מניות ב 2 mL הבליטים של אנזימים ולאחסן אותם ב ~-20 ° צ’ עד השימוש. לאורך זמן, עם זאת, מניות קפוא (מאוחסן עד 2 שבועות) יכול לאבד פעילות אנזימטית שלהם. המשתנה השלישי מתייחס לטמפרטורה של טיפולי עיכול אנזימים. פעילויות אנזימטיות של פפאין ו הקולגנאז להציג תלות טמפרטורה. Papain ו-קולגן סוג II פעילות התערוכה בטווחים טמפרטורה המקיף פיזיולוגיה הגוף הרגיל67,68. לכן, אנו שואפים לשמור על טיפולי האנזים יציבים ב-~ 37 ° c הימנעות טמפרטורות גבוהות יותר כדי לשמור על שלמות התא DSM. השיקול הרביעי מדאיג את השונות של איכות תאי ה-DSM הנמצאים בתוך כל הכנה החל מאוד קיימא (מציג מצוין מאפייני שריר חלקה קלאסית) לתאים לא בריאים, מתעכל יותר. מרווח הדגירה האנזים ממושך היא אחת הסיבות העיקריות להשגת מספר גבוה של תאים פגומים. טיפולים אנזימים מוגזמת פוגעים גם במבני חלבונים של ערוצי יונים, קולטנים ושנאים, להשפיע לרעה על הפונקציונליות שלהם. פרשנות של תוצאות שהתקבלו מתוך אנזימטי, תאים מבודדים טרי צריך לשאת את השיקול הזה בראש. אופטימיזציה של התנאים לעיכול אנזימים שואפת להגדיל את אחוז התאים הקיימא ביותר. גישות ניסיוני להסתמך על מספר גבוה יותר של תאים קיימא כגון ניתוחים microarray דורשים מיטוב חזקים יותר מאשר אלה ביצעו בהצלחה על פחות תאים כגון תיקון תא בודד-מלחציים אלקטרופיזיולוגיה או Ca2 + הדמיה. התחשבות בגורמים הנ ל הנחה את מאמצי המחקר שלנו בעשור האחרון בהשגת תאים בעלי איכות גבוהה בודדת DSM.
הטכניקה מחורר הטלאי הפטנט כבר הגישה האלקטרולוגית החשמלית במשך רבע מאה. מספר פרסומים מספקים פירוט של השיקולים הטכניים69,70,71,72,73. ניקוב תאים ניתן להשיג עם אמפוריטיצין-B, nystatin, מגרסידין, או β-escin (ראה הפניה32למבט כולל על כל אחד מהם). היתרון העיקרי של הקלטות מחורר הדבקה הצמד על פני גישות אלקטרופיזיולוגיות אחרות היא כי הסביבה תאיים הילידים-כולל Ca תאיים2 +ואיתות מולקולות (למשל, מחנה, PKA, פוספטים, ו זרחן)-נשמר. טכניקה זו, מכאן, מתאימה באופן אידיאלי לחקירת זרמים של ערוצי יונים שלמים ומנגנוני הרגולציה שלהם בתנאים פיזיולוגיים. האזהרה מפתח היא כי הרכב התא תאיים לא יכול להיות נשלט בדיוק בניגוד שיטות אלקטרופיזיולוגיות אחרות כגון רגיל-תא כולו ו-הערוץ יחיד-טלאי (בפנים ומחוץ לבית) הקלטות. בניסיון שלנו, שלושה גורמים לתרום באופן שגרתי התוצאות הנסיוניות מוצלחת של אמפוריטיצין-B-מחורר ניסויים מלחציים טלאי. הראשונה היא האיכות של תא ה-DSM שנבחרה לנסות הקלטה. כאשר תאי DSM הם מאוד קיימא הצגת למחצה הקונקטילה (דמוי סרפנטיין), מראה מבריק בחדות גבוהה עם הילה מוגדרת היטב סביב משטח התא ולהצמיד היטב לתחתית הזכוכית של חדר ההקלטה ולאחר מכן giga-חותם היווצרות תא ניקוב מתרחשים יחסית קל. הגורמים השני והשלישי להצלחה, בהתאמה, להתייחס לאיכות של מקור ומסיסות של אמפוריטיצין-B (בתוך diמתיל סולפוקסיד/DMSO ופתרון הצינורות התאיים). הבחנו בסתירות בין ספקים שונים במונחים של מקור ושונות הרבה יכולות. בכל יום אנו מכינים פתרון טרי של אמפוריטיצין-B פתרון מניות מאבקה ואחריו דילול התמיסה התאיים. שלבים אלה דורשים sonication נרחב ומורטקסנג. עם האמפוריטיצין-B המכיל פתרון פיפטה טרי, ניקוב תאים מוצלח (+, קליפורניה2 +, וזרמים לא סלקטיבית מתאי ה-DSM האנושיים, השפן, העכבר, ו/או העכברים17,21,22,23,29,30,31,35,60. כאן, אנו מתארים תנאים להקלטת זרמים לא סלקטיבית של הקטיון בתאי ה-DSM האנושיים. 9-פניל, חוסם של ערוצים TRPM4, זרמים מחליש בשלב המתח המושרה לתמוך בתפקיד של ערוצים אלה בשליטה של היכולת של ה-DSM. כהערה, זה בדרך כלל דורש לפחות 45 דקות לאחר קבלת החותם giga וחניכה של ניקוב כדי להקליט את המתח האופטימלי של הזרם הגבוה המושרה זרמים היון לא סלקטיבי. רמפות מתח יכול לשמש גם כחלופה לפרוטוקולים שלב מתח30,64. כאן, פרוטוקול של צעד מתח מן הפוטנציאל המחזיק מקוטב השפעה היה מועדף ולא פרוטוקול רמפה מאז הגישה לשעבר ממזער את ההשפעה של הפעלה תלויה מתח ומאפשר בממוצע של זרם מעורר על משך זמן של מתח-שלב שבו השיפוע מספק נקודת נתונים אחת לכל מתח. הנקודה האחרונה מתייחסת במיוחד לתאי ה-DSM האנושיים כאשר הזרמים מציגים פעילות משתנה במהלך צעדי מתח (איור 5ואיור 6). הטכניקה האמפוריטיצין-B מחורר לתיקון, הכרחית בזיהוי המאפיינים של תאי DSM וסוגי תאים אחרים, וימשיכו לספק מספר תגליות בעתיד. יתרה מזאת, ניתן להשתמש בהצלחה בתאים מבודדים של DSM בודד עבור מדידת תא שלם K+, קלרנית–, ו-Ca2 +זרמים עם המצב המקובל של טכניקת המדבקה, ההקלטה הפוטנציאלית עם המלחציים הנוכחיים, והקלטות ערוץ יחיד כפי שאנו מדגיבים את הדיווחים הקודמים שלנו23,29,35,64.
בנוסף לתיקון תאים בודדים-קלאמפ שיטות, תאים בודדים DSM מבודדים ניתן ללמוד עם גישות טכניות אחרות כולל Ca2 + הדמיה, RT-pcr/q-RT-PCR, אימונוציטוטוכימיה, בסמיכות באתרו בקירבה, וגישות גנומית (g., microarray, RNA-seq, שבב-seq)15,18,303433, כמו תא יחיד ההמרה שיטות ההגדרה להמשיך להתפתח ולהיות רגיש מאוד, אנו לדמיין את היכולת העתידית לקשר באופן שגרתי ובמיוחד הקישור תכונות החשמל או תרופתי של תאים DSM בודדים עם ההמרה שלהם פרופילים. זה יהיה מושגת על ידי ההקלטה הראשונה מתא DSM ולאחר מכן חילוץ mRNA או חלבון ואחריו הטרנססקריפט/פרוטאנדומית ניתוח. למרות ששיטות כאלה נבדקו כבר בתאים שאינם-DSM, הם נמצאים כרגע מאתגרת טכנית, חוסר רגישות להיחשב שגרתי, ומוגבל לגילוי מוצלח של כמה מוצרים גנים נבחרים74. פונקציה-ביטוי הפרופיל המולקולרי המקשר מחקרים כאשר נעשה על התאים DSM שהתקבלו שלפוחיות שתן שנגזר שליטה וחולים חולים-תורמים תספק תובנות לתהליכים פיזיולוגיים חיוניים לנהיגה פונקציות DSM רגיל, פתוגנזה, ובזיהוי גישות אפקטיביות הרומן הרפואי.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי NIH-R01DK106964 ו P20DK123971 מענקים לגאורגי V. פטקוב. המחברים מודים לד ר ויקטור יאררוצצקי ו גברת שרה מקסוול על הערכה קריטית של כתב היד. אנחנו גם אסירי תודה על מנתחים הצוות של אורולוגיה ב MUSC ו UTHSC: ד”ר תומס קין, הארי קלארק, סטיבן סאבאג ‘, רוס Rames, Sandip סאד, ג’ונתן פיקארד, כריסטופר Ledbetter יותר, אנתוני פטרסון, כמו גם התושבים MUSC ו UTHSC אורולוגיה: ד”ר. טיילור ווהן, סמואל ווקר Nickles, מתיו יאנג, ארין ברנס, ג’סטין אללט, ריאן לייני, אוסטין יאנגר, מארק קורי, נימה ברדראן, מקוי מק, טרייסי טיפטון, ברייס וויאט, אליסה גריימן, שרה Starosta, אהרון בלוך, כריסטין קאלדרך, לוסיל קוקס, כריסטיאן Dewan, ארין הטמן, בראדלי יוסטון, סטיבן לג, רוברט ס. ליבי, קול לוקליר, קריסטן מארלי, מוניקה או’נלון, פטריק פרובסט, סינתיה שרעדין, אליזבת Tourville, דניאל זפאטה עבור עזרתם עם אוסף רקמות האדם.
5 ml polystyrene round-bottom tube | Falcon | 352054 | Tubes for DS containing enzymes used in digestion steps |
9-Phenanthrol | Sigma-Aldrich | 211281 | TRPM4 channel inhibitor |
Amphotericin-B | Fisher | BP928-250 | Used for patch/cell perforation |
Amphotericin-B | European Pharmacopoeia Reference Standards | 5 | Used for patch/cell perforation |
Amphotericin-B | Sigma-Aldrich | A9528-100MG | Used for patch/cell perforation |
Analog vortex mixer | VWR | 58816-121 | |
Aspartic acid | Sigma-Aldrich | A9006 | Intracellular pipette solution |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | DS |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | Extracellular solution and DS |
Capillary Glass | Sutter | BF150-110-7.5 | Capillary for preparation of pulled patch electrodes |
Cesium hydroxide hydrate | Sigma-Aldrich | C8518 | Intracellular pipette solution |
Clampex ver. 10 software includes data acqusition (Clampex) and analysis (Clampfit) programs | Axon Instruments/ Molecular Devices | pCLAMP-10 | Commerical software and part of patch-clamp rig setup |
Collagenase type 2 | Worthington Biochemical Corporation | LS004177 | DS-C |
CsCl | Sigma-Aldrich | 203025 | Extracellular and intracellular solutions |
Dental wax | Miltex Dental Wax Technologies, Inc. | 18058351 | |
Digital Thermometer with Probe | Fisher Scientific | 15-077-32 | Placed in tissue bath to monitor temperature |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Solvent |
DL-Dithiothreitol (DDT) | Sigma-Aldrich | D9779 | Reducing agents used together with Papain |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | Ca2+ chelator, used in intracellular pipette solution |
Flaming/Brown micropipette puller | Sutter | P-97 | Required to pull electrodes with very fine tips |
Floating foam tube rack/holder | VWR Scientific | 82017-634 | Used for holding tubes with enzymes for temperature control |
Glucose | Sigma | G8270 | |
Glutamic acid (Na salt) | Sigma-Aldrich | G1626 | DS |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | pH Buffer |
KCl | Fisher Scientific | BP366-1 | Extracellular solution |
Low Noise Data Acquisition System | Axon Instruments/ Molecular Devices | Digidata 1440A | Part of patch-clamp rig setup |
Magnetic stirrer | VWR | 01-442-684 | |
MgCl2 (hexahydrate) | Sigma-Aldrich | M2670 | Extracellular and intracellular solutions |
MicroForge | Narishige | MF-830 | Used for fire-polishing electrodes |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | Extracellular and intracellular solutions |
NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | |
Nifedipine | Sigma-Aldrich | N7634 | L-type voltage-gated Ca2+ channel blocker |
Nikon inverted microscope, TS100 with T1-SM stage with 5x, 10x, 20x, and 40x objectives | Nikon | Discontinued | Part of Patch-clamp rig setup |
Non-metalic syringe needle, MicroFil | WPI | MF-34G-5 | Filling of intracellular pipette solution |
Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | DS-P |
Pasteur pipette | FisherBrand | 13-678-20A | Tips are broken off and fire-polished and used for titration of enzymatically treated tissues to release single DSM cells from pieces |
Patch-clamp amplifier | Axon Instruments/ Molecular Devices | Axon Axopatch 200B | Part of patch-clamp rig setup |
PC computer | DELL | Custom configuration | Part of patch-clamp rig setup |
pH Meter | Aspera Instruments | PH700 | |
Polyethylene tubing | Intramedic | 427-436 | Tubing for superfusion of extracellular bath connected to glass-bottom recording chamber |
Tetraethylammonium chloride | Sigma-Aldrich | T2265 | Ion channel blocker of Kv and BK channels added to the extracellular bath solution |
Thermo Scientific Precision shaking water bath (model 2870) | Thermo Scientific | Discontinued | Water bath for temperature control of enzymatic digestion employed as an alternative to tissue chamber-circulating bath setup |
Tissue bath, 100 mL | Radnoti | 1583-101 | Connected to a circulating bath and filled with water, tubes with DS and DSM pieces are placed in the setup to control the temperature of digestion steps |
Vinyl tubing | ColePalmer | 06405-3 | Multiple uses including for connecting tissue bath to circulating water bath |
Water circulator bath, Haake D1 L | Haake | Discontinued | Connected to tissue bath |
Weighting scale | Mettler Toledo | XS64 | |
ZeissAxiovert 40C inverted microscope with 10x and 40x objectives | Carl-Zeiss | Discontinued | Part of patch-clamp rig setup |