kinase inhibitors की स्क्रीनिंग के लिए स्वयं इकट्ठे मानव प्रोटीन microarrays की पीढ़ी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है.
kinase inhibitors की स्क्रीनिंग एक दवा के गुणों को बेहतर समझने के लिए और नैदानिक प्रभाव के साथ संभावित नए लक्ष्यों की पहचान के लिए महत्वपूर्ण है. ऐसी स्क्रीनिंग को पूरा करने के लिए कई तरीकों की सूचना दी गई है। हालांकि, प्रत्येक की अपनी सीमाएं हैं (उदाहरण के लिए, केवल एटीपी एनालॉग की स्क्रीनिंग, शुद्ध kinase डोमेन का उपयोग करने के लिए प्रतिबंध, एक समय में कुछ kinases से अधिक परीक्षण के साथ जुड़े महत्वपूर्ण लागत, और प्रोटीन kinases स्क्रीनिंग में लचीलेपन की कमी के साथ उपन्यास उत्परिवर्तन). यहाँ, एक नया प्रोटोकॉल है कि इन सीमाओं में से कुछ पर काबू पाने और kinase inhibitors के निष्पक्ष स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता प्रस्तुत किया है. इस विधि की एक ताकत कई प्रोटीन भर में kinase inhibitors की गतिविधि की तुलना करने की क्षमता है, या तो अलग kinases या एक ही kinase के विभिन्न वेरिएंट के बीच. एक मानव आधारित इन विट्रो प्रतिलेखन और अनुवाद प्रणाली (IVTT) द्वारा प्रोटीन kinases की अभिव्यक्ति के माध्यम से उत्पन्न स्वयं इकट्ठे प्रोटीन microarrays कार्यरत हैं. microarray पर प्रदर्शित प्रोटीन सक्रिय हैं, kinase inhibitors के प्रभाव की माप के लिए अनुमति देता है. निम्न कार्यविधि प्रोटोकॉल चरणों का विस्तार से वर्णन करती है, माइक्रोरेरे जनरेशन और स्क्रीनिंग से डेटा विश्लेषण तक.
प्रोटीन kinases अपने लक्ष्य के फॉस्फोरिलेशन के लिए जिम्मेदार हैं और जटिल आणविक रास्ते है कि कई सेलुलर कार्यों को नियंत्रित (यानी, सेल प्रसार, भेदभाव, सेल मौत और अस्तित्व) को नियंत्रित मोड्यूल कर सकते हैं। kinase गतिविधि के विनियमन 400 से अधिक रोगों के साथ जुड़ा हुआ है, kinase inhibitors कैंसर, हृदय और तंत्रिका संबंधी विकारों के साथ ही भड़काऊ सहित कई रोगों के उपचार के लिए उपलब्ध दवाओं के मुख्य वर्गों में से एक बना और ऑटोम्यून्यून रोग1,2,3.
सटीक चिकित्सा के आगमन के साथ, नए उपचार की पहचान, विशेष रूप से kinase inhibitors, महान अपील दवा और चिकित्सकीय है. काइनेज इनहिबिटर ोंके डे नोवो डिजाइन और मौजूदा एफडीए-अनुमोदित औषधियों के लिए नए लक्ष्यों की पहचान सहित काइनेज/किनेस इनहिबिटरों के संभावित नए जोड़े की पहचान के लिए कई दृष्टिकोणों का उपयोग किया जा सकता है। बाद विशेष रूप से आकर्षक है, के बाद से समय और पैसे क्लीनिक में इन दवाओं को लागू करने के लिए आवश्यक काफी पिछले नैदानिक परीक्षण डेटा की उपलब्धता के कारण कम कर रहे हैं. एक kinase अवरोध करनेवाला के repurposing का एक विहित उदाहरण imatinib है, शुरू में बीसीआर-Abl के निषेध के माध्यम से पुरानी myelogenous ल्यूकेमिया (सीएमएल) के उपचार के लिए डिजाइन, जो भी सफलतापूर्वक सी-किट के उपचार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है अधिक-व्यक्त जठरांत्र stromal ट्यूमर (GISTs)4,5,6,7.
काइनेज अवरोधकों की स्क्रीनिंग बाध्यकारी परख या एंजाइमी आधारित परख में की जा सकती है। परख के प्रथम श्रेणी प्रोटीन दवा बातचीत पर केंद्रित है और इस तरह के ligation साइट और आत्मीयता के रूप में जानकारी प्रदान कर सकते हैं. चूंकि इन परख के समय kinase की गतिविधि अज्ञात है, बातचीत के एक नंबर याद किया जा सकता है या गलत प्रोटीन में अनुरूप परिवर्तन के कारण पहचान की. दूसरी ओर, एंजाइमी आधारित परख प्रोटीन kinases सक्रिय होने की आवश्यकता है और एंजाइम गतिविधि पर अवरोध करनेवाला के प्रभाव के बारे में बहुमूल्य जानकारी प्रदान करते हैं, तथापि, स्क्रीनिंग के इस प्रकार आम तौर पर अधिक समय लगता है और महंगा है. वर्तमान में, परख के दोनों प्रकार के कई स्रोतों से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं. वे कुछ सीमाओं के साथ kinase inhibitors की स्क्रीनिंग के लिए एक विश्वसनीय विकल्प का प्रतिनिधित्व करते हैं, सहित: मैं) तरीकों के अधिकांश कई kinases व्यक्तिगत रूप से परीक्षण शामिल है, जो प्रोटीन का एक बड़ा सेट की स्क्रीनिंग महंगा कर सकते हैं; II) परीक्षण किया जा करने के लिए kinases के सेट preselected, जंगली प्रकार kinases और कुछ kinases के कई प्रसिद्ध उत्परिवर्तित संस्करणों की एक सूची तक ही सीमित है, कई नए उत्परिवर्तित isoforms के परीक्षण में बाधा.
इस संदर्भ में, प्रोटीन microarrays व्यावसायिक रूप से उपलब्ध तकनीकों द्वारा प्रस्तुत सीमाओं में से कुछ पर काबू पाने में सक्षम एक शक्तिशाली मंच हैं. यह ब्याज के किसी भी अनुक्रम के पूर्ण लंबाई, सक्रिय प्रोटीन का उपयोग कर उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग में एंजाइमी आधारित परख प्रदर्शन करने के लिए उपयुक्त है। microarrays NAPPA (न्यूक्लिक एसिड प्रोग्राम प्रोटीन सरणी) की तरह एक आत्म इकट्ठे दृष्टिकोण द्वारा उत्पन्न किया जा सकता है, जिसमें प्रोटीन सिर्फ परख के लिए समय में व्यक्त कर रहे हैं, संभावना है कि सरणी पर प्रदर्शित उन वास्तव में सक्रिय हैं बढ़ रही है. NAPPA पर प्रदर्शित प्रोटीन प्राकृतिक तह और गतिविधि की संभावना में सुधार करने के क्रम में मानव व्युत्पन्न राइबोसोम और chaperone प्रोटीन का उपयोग कर उत्पादन कर रहे हैं.
प्रोटीन शुरू में एक कब्जा टैग के साथ जुड़े ब्याज के जीन के लिए कोडिंग cDNAs मुद्रण द्वारा क्रमादेशित रहे हैं, एक कब्जा एजेंट के साथ, microarray सतह पर. प्रोटीन तो एक इन विट्रो प्रतिलेखन और अनुवाद (IVTT) प्रणाली का उपयोग कर microarrays पर उत्पादित कर रहे हैं, और ताजा व्यक्त प्रोटीन कब्जा एजेंट द्वारा microarray सतह पर स्थिर कर रहे हैं. व्यक्त एनपीए सरणियों का उपयोग सरणी पर प्रदर्शित प्रोटीनों के अध्ययन के लिए एक निष्पक्ष, उच्च थ्रूपुट तरीके से किया जा सकताहै 8,9.
पहले, यह दिखाया गया था कि NAPPA सरणियों पर प्रदर्शित प्रोटीन ठीक से मोड़ रहे हैं ज्ञात भागीदारों के साथ बातचीत करने के लिए10; इसके अलावा, उनकी एंजाइमी गतिविधि पहली बार 2018 में शोषण किया गया था, जब यह दिखाया गया था कि प्रोटीन kinases microarray autophosphorylate11पर प्रदर्शित . आज तक, नेपा पद्धति का उपयोग कई विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए किया गया है , जिनमें बायोमार्कर खोज12,13,14,15,16,17, प्रोटीन प्रोटीन बातचीत10,18, सब्सट्रेट पहचान19, और दवा स्क्रीनिंग11. इसका लचीलापन मंच की प्रमुख विशेषताओं में से एक है जो प्रत्येक आवेदन के लिए अनुकूलन की अनुमति देता है।
यहाँ, स्वयं इकट्ठे NAPPA सरणियों में tyrosine kinase inhibitors की स्क्रीनिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है. मंच सक्रिय मानव प्रोटीन kinases के प्रदर्शन के लिए और प्रोटीन kinase गतिविधि के विश्लेषण के लिए अनुकूलित है, कम पृष्ठभूमि और उच्च गतिशील रेंज के साथ. kinase inhibitors की स्क्रीनिंग के लिए NAPPA का उपयोग करने के लिए लागू संशोधनों में शामिल हैं: मैं) मुद्रण रसायन विज्ञान में परिवर्तन, द्वितीय) kinase अवरोधक स्क्रीनिंग से पहले प्रोटीन microarray के de-फॉस्फोरिलेशन, और III) का पता लगाने का अनुकूलन सरणी पर फॉस्फोरीयुक्त प्रोटीन. यह प्रोटोकॉल अपनी तरह का पहला प्रोटोकॉल है और एनपीए माइक्रोरेरेसिस में काइनाज अध्ययन के बारे में अद्वितीय जानकारी प्रदान करता है।
संशोधन और समस्या निवारण
NAPPA सरणियों पर kinase गतिविधि के अध्ययन के अनुकूलन चरण के दौरान, पृष्ठभूमि और कम गतिशील रेंज के मुख्य स्रोतों में से एक मनाया बीएसए मुद्रण मिश्रण पर इस्तेमाल किया गया था. बीएसए अमीनों की सतह से क्रॉसलिंकिंग के लिए आवश्यक प्राथमिक अमीन उपलब्ध करा रहे थे और मौके पर ही डीएनए और कैप्चर एंटीबॉडी को फंसा रहे थे। हालांकि, बीएसए अत्यधिक फॉस्फोरीलेटेड है, जिससे पृष्ठभूमि शोर के ऊपर सरणी पर ऑटोफॉस्फोरिलेशन सिग्नल का पता लगाने के लिए यह मुश्किल हो जाता है। इस समस्या को हल करने के लिए, मुद्रण मिश्रण में बीएसए के लिए कई विकल्पों का परीक्षण किया गया था, और पाली-lysine अच्छा विकल्प के रूप में पहचान की गई थी। पाली-लाइसिन में फॉस्फोरिलेशन साइट का अभाव है; इसलिए, गैर-एक्सप्रेस्ड सरणियों से पृष्ठभूमि बहुत कम है। इसके अतिरिक्त, पॉली-लाइसिन के साथ मुद्रित माइक्रोरेरेस पुन: उत्पादनीय होते हैं और प्रोटीन के अच्छे स्तर प्रदर्शित करते हैं (चित्र 2)।
मानक NAPPA पर प्रदर्शन अगले महत्वपूर्ण संशोधन एक Phosphatase / फॉस्फेटके के साथ माइक्रोरेरेसिस का उपचार प्रोटीन संश्लेषण और ग्रहण के दौरान आईवीटीटी मिश्रण में हुई किसी भी फॉस्फोरिलेशन को हटाने की अनुमति देता है (चित्र 3) । इस फॉस्फोरिलेशन का स्रोत आंतरिक स्वाफॉस्फोरिलेशन क्रिया कला से अथवा आईवीटीटी मिश्रण में उपस्थित किनासे की गतिविधि से हो सकता है। सभी फॉस्फोरिलेशन पोस्ट-एक्सप्रेशन को हटाने से सक्रिय किनियों की आसान पहचान की अनुमति दी जाती है और वे ऑटोफॉस्फोरिलेशन से गुजर सकते हैं (चित्र 3)।
प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम
NAPPA एक मजबूत तकनीक है, लेकिन जैसा कि उम्मीद है, वहाँ कई महत्वपूर्ण कदम हैं. पहले उचित एकाग्रता में उच्च गुणवत्ता डीएनए के अधिग्रहण है. गरीब गुणवत्ता के डीएनए का उपयोग करना या कम सांद्रता में कई सुविधाओं के साथ गरीब गुणवत्ता microarrays उत्पन्न होगा व्यक्त नहीं किया जा रहा है और उचित स्तर में प्रदर्शित, सरणी पर विश्लेषण प्रोटीन की संख्या कम. दूसरा महत्वपूर्ण कदम microarray पर प्रोटीन की अभिव्यक्ति है. एक IVTT प्रणाली है कि कार्यात्मक प्रोटीन के उच्च स्तर को व्यक्त करेंगे का उपयोग सरणी पर kinase गतिविधि का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है.
TKI स्क्रीनिंग पर अगले महत्वपूर्ण कदम है कि microarrays कैसे संभाला जाता है. microarrays प्रोटोकॉल के किसी भी कदम के दौरान सूखी नहीं होना चाहिए, और कोमल हैंडलिंग खरोंच है कि पृष्ठभूमि संकेत बढ़ा सकते हैं को रोकने के लिए सिफारिश की है. चूंकि पूरे प्रयोग की सरणियों की तुलना एक-दूसरे से की जाएगी, इसलिए यह आश्वस्त करना महत्वपूर्ण है कि सभी स्लाइड्स में हर ऊष्मायन चरण भी है. उदाहरण के लिए, जब 20 सरणियों का एक बैच सरणीओं में इनक्यूबेशन की लंबाई में अंतर को रोकने के लिए संसाधित किया जाता है, तो किसी एकल सरणी में एक चरण निष्पादित करने के लिए आवश्यक समय को ध्यान में रखा जाना चाहिए।
अंत में, प्रयोग का डिज़ाइन और सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण दोनों को शामिल करना गुणवत्ता नियंत्रण और डेटा विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है. नियंत्रण का पहला सेट उन प्रत्येक सरणी में मुद्रित कर रहे हैं और नकारात्मक नियंत्रण शामिल हैं [यानी, खाली धब्बे (किसी भी सामग्री मुद्रित के बिना), पानी या खाली वेक्टर (केवल टैग एक्सप्रेस)], साथ ही साथ एक सकारात्मक नियंत्रण (यानी, शुद्ध IgG, कि द्वारा पता चला है द्वितीयक एंटीबॉडी और फॉस्फोरिलेशन स्तर में परिवर्तन करने के लिए निष्क्रिय है। सामूहिक रूप से, वे microarray की पृष्ठभूमि के स्तर को मापने, मुद्रण के दौरान संभव carryover और पता लगाने की विधि के संकेत तीव्रता.
नियंत्रण के अगले सेट दवा स्क्रीनिंग नियंत्रण कर रहे हैं और dephosphorylated और autophosphorylated microarrays शामिल हैं (DMSO की उपस्थिति या अनुपस्थिति में). जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, डेफॉस्फोरिलेटाइन्ड माइक्रोरेरे फॉस्फेटेज उपचार के बाद फॉस्फोरिलेशन के स्तर को मापते हैं और इसलिए अन्य सभी प्रयोगों के लिए आधारभूत स्तर होते हैं। कम आधाररेखा स्तर है, उच्च assays के गतिशील रेंज. ऑटोफॉस्फोरीलेटेड सरणियां सभी सरणियों के अधिकतम फॉस्फोरिलेशन स्तर मौजूद हैं और संकेत मजबूत और स्पष्ट होना चाहिए। यह डेटा विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाता है, लेकिन यह भी एक नियंत्रण है कि सभी प्रतिक्रियाओं को सफलतापूर्वक सरणी पर प्रदर्शन किया गया के रूप में।
तकनीक की सीमाएं
अब के रूप में, यहाँ प्रस्तुत दवा स्क्रीनिंग की सीमाओं में से एक केवल प्रोटीन kinases कि autophosphorylated किया जा सकता है स्क्रीन करने की क्षमता है. इस पर काबू पाने के लिए एक संभव तरीका एक ही स्थान में एक kinase और ज्ञात सब्सट्रेट मुद्रित करने के लिए है। दो अलग प्रोटीन के लिए डीएनए के सह मुद्रण सफलतापूर्वक15पूरा किया गया था, इस दृष्टिकोण की व्यवहार्यता का सुझाव. इसके अलावा, सरणी पर प्रदर्शित प्रोटीन सही ढंग से एक निष्क्रिय प्रोटीन में जिसके परिणामस्वरूप जोड़ नहीं किया जा सकता है. मानव आधारित अभिव्यक्ति प्रणाली के उपयोग ने सरणी पर मापी गई काइनेज़ गतिविधि में महत्वपूर्ण सुधार किया; हालांकि, कुछ प्रोटीन अभी भी अपनी निष्क्रियता के कारण सरणी पर विश्लेषण नहीं किया जा सकता है.
एक दूसरी सीमा एक पैन विरोधी फॉस्फो-टायर एंटीबॉडी का उपयोग कर फॉस्फोरिलेशन की माप है। फॉस्फोरिलेशन साइट की आकृति के बारे में अपनी गैर-विशिष्टता के बावजूद, सभी मापा फॉस्फोरिलेशन टायरोसिन अवशेषों पर हुई, serines और threonines और उनके संबंधित kinases पीछे छोड़ने. आज तक, ऊष्मायन और धुलाई की स्थिति को अनुकूलित करने के कई प्रयासों के बावजूद, सफलता के बिना 10 से अधिक पैन फॉस्फो-सेर/थ्र एंटीबॉडी का परीक्षण किया गया है। एंटीबॉडी से स्वतंत्र एक नई पहचान प्रणाली प्रोटीन kinases कि दवा निषेध के लिए जांच की जा सकती है की संख्या का विस्तार करने के लिए सबसे अच्छा विकल्प हो सकता है. इस संदर्भ में, कुछ विकल्प रेडियोधर्मिता या क्लिक संयोजन जैसे रासायनिक दृष्टिकोण सहित उपलब्ध हैं. अनुकूलन की एक श्रृंखला पृष्ठभूमि संकेत को कम करने और परख के लिए एक अच्छा गतिशील रेंज प्रदान करने के लिए आवश्यक हैं.
तीसरी सीमा cDNA क्लोन के अधिग्रहण सरणी पर मुद्रित किया जा करने के लिए है. CDNA क्लोन ऐसे निर्माता या गेटवे23के रूप में साइट विशेष पुनर्संयोजन प्रणाली, सहित किसी भी क्लोनिंग तकनीक का उपयोग कर उत्पन्न किया जा सकता है। एक अन्य विकल्प के लिए DNAsu पुस्तकालय से क्लोन खरीद रहा है, पर पाया और lt;https://dnasu.org/DNASU/Home.do,जहां 17,000 से अधिक cDNAs क्लोन, पूरे मानव kinome सहित, आसानी से उपलब्ध है NAPPA सरणियों के निर्माण के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए24 .
चौथी सीमा यह है कि हर प्रयोगशाला में अपने स्वयं के एनपीए सरणियों को बनाने और स्क्रीन करने के लिए उपयुक्त उपकरण ों की सुविधा नहीं है। इस प्रोटोकॉल के लिए उच्च throughput उपकरण की आवश्यकता के बिना, microarray पर मुद्रित किया जा करने के लिए डीएनए उत्पन्न करने के लिए वैकल्पिक तरीके प्रदान करता है, और प्रोटोकॉल मैन्युअल रूप से सभी संकरीकरण कदम प्रदर्शन करने के लिए. हालांकि, एक arrayer और microarray स्कैनर के लिए उपयोग अभी भी आवश्यक है। इस मुद्दे को दूर करने के लिए एक विकल्प के लिए NAPPA कोर सेवा और सुविधा का उपयोग करने के लिए है, पर पाया और http://nappaproteinarray.org/gt;, जो एक गैर लाभ शैक्षणिक मूल्य पर अनुकूलित NAPPA microarrays वितरित करता है. अंत में, किसी भी स्क्रीनिंग पद्धति के रूप में, सरणियों पर प्राप्त डेटा कलाकृतियों होने के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं (या तो सकारात्मक या नकारात्मक) और इसलिए orthogonal परख का उपयोग कर मान्य किया जाना चाहिए.
मौजूदा तरीकों के संबंध में महत्व
प्रोटीन kinases की स्क्रीनिंग के लिए व्यावसायिक रूप से कई प्लेटफार्मों उपलब्ध हैं. एक दृष्टिकोण नियमित रूप से इस्तेमाल किया बाध्यकारी assays है, जो प्रोटीन टुकड़े, kinase डोमेन, kinase डोमेन और कुछ नियामक क्षेत्रों के साथ बड़ा प्रोटीन टुकड़े के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है, और यहां तक कि पूर्ण लंबाई प्रोटीन. प्रोटीन आमतौर पर लागत और अभिव्यक्ति और शोधन प्रोटोकॉल में सादगी के कारण जीवाणु प्रणालियों में व्यक्त कर रहे हैं. ब्याज और प्रोटीन की दवा के बीच बातचीत तो फ्लोरोसेंट या टैग की उपस्थिति की तरह रिपोर्ट परख के कुछ प्रकार के साथ मापा जाता है, उदाहरण के लिए. दृष्टिकोण के इस सेट की मुख्य सीमा तथ्य यह है कि प्रोटीन दवा के साथ बातचीत के दौरान जरूरी सक्रिय नहीं है, जो झूठी सकारात्मक और झूठी नकारात्मक बातचीत की पहचान में परिणाम हो सकता है. प्रोटीन टुकड़े विशेष रूप से रचना और गतिविधि की कमी में परिवर्तन के लिए कमजोर कर रहे हैं और सभी प्राप्त डेटा सक्रिय प्रोटीन का उपयोग कर मान्य किया जाना चाहिए, अधिमानतः उनके पूर्ण लंबाई के रूप में. प्लेटफार्मों में से कुछ की एक और सीमा केवल एटीपी एनालॉग स्क्रीन करने की क्षमता है, इसके समग्र उपयोग को सीमित.
एंजाइमी आधारित दृष्टिकोण का उपयोग कर TKIs की स्क्रीनिंग के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेवाओं के अधिकांश ब्याज की kinase के केवल जंगली प्रकार के संस्करणों का उपयोग, और कभी कभी केवल एक चयनित कुछ म्यूटेंट. यह जानते हुए कि दवा प्रतिरोध TKI के साथ इलाज रोगियों में बहुत आम है, यह सबसे उपयुक्त अवरोध करनेवाला के चयन के लिए, विभिन्न म्यूटेंट में दवा की प्रतिक्रिया को मापने के लिए सक्षम होने के लिए महत्वपूर्ण है। NAPPA की प्रकृति के कारण, kinase म्यूटेंट की स्क्रीनिंग सरल है और आसानी से पूरा किया जा सकता है, और केवल आवश्यक उपकरण NAPPA CDNA संग्रह में kinase उत्परिवर्ती का समावेश है, जो साइट-विशिष्ट mutagenesis द्वारा किया जा सकता है, उदाहरण के लिए.
भविष्य अनुप्रयोगों
कैंसर चिकित्सा में कैंसर चिकित्सा में कैंसर के सबसे आम रूपों में से एक का इलाज पाठ्यक्रम के दौरान दवा के लक्ष्य में उत्परिवर्तनों का अधिग्रहण है। प्रत्येक रोगी के लिए एक व्यक्तिगत उपचार प्राप्त करने के लिए टीकेआई की दूसरी/तीसरी पीढ़ी के चयन के लिए काइनेज अवरोधकों के प्रति उनकी प्रतिक्रिया के संबंध में इन म्यूटेंटों की स्क्रीनिंग महत्वपूर्ण महत्व की है। यहाँ प्रस्तुत दवा स्क्रीनिंग दृष्टिकोण, एक निष्पक्ष स्क्रीनिंग मंच प्रदान करता है जिसमें किसी भी टायरोसिन किनेस अवरोधक मानव जीनोम में मौजूद टायरोसिन kinases के एक पैनल के खिलाफ परीक्षण किया जा सकता है। चूंकि NAPPA सरणियों पर प्रदर्शित प्रोटीन स्लाइड पर मुद्रित cDNA से इन विट्रो में व्यक्त कर रहे हैं, किसी भी उत्परिवर्ती संस्करण आसानी से सरणी पर प्रदर्शित करने के लिए cDNA संग्रह में शामिल किया जा सकता है. सुविधा जिसमें kinase म्यूटेंट उत्पन्न किया जा सकता है और सरणी पर व्यक्त, NAPPA तकनीक के उच्च throughput शक्ति के साथ संयुक्त, kinase म्यूटेंट के अध्ययन और दवाओं के लिए उनकी प्रतिक्रिया के लिए एक अनूठा वातावरण प्रदान करता है, NAPPA के लिए उपयुक्त बनाने व्यक्तिगत दवा स्क्रीनिंग, सटीक चिकित्सा के लक्ष्यों में से एक.
The authors have nothing to disclose.
लेखक परियोजना के विकास के दौरान उनकी मदद और आलोचना के लिए LaBaer प्रयोगशाला में सभी को धन्यवाद देना चाहूंगा. इस परियोजना NIH अनुदान U01CA117374, U01AI077883 और वर्जीनिया जी पाइपर फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था.
Reagent/Material | |||
364 well plates (for arraying) | Genetix | x7020 | |
800 µL 96-well collection plate | Abgene | AB-0859 | |
96-pin device | Boekel | 140500 | |
Acetic Acid | Millipore-Sigma | 1.00066 | |
Acetone 99.9% | Millipore Sigma | 650501 | |
Aluminum seal for 96 well plates | VWR | 76004-236 | |
Aminosilane (3-aminopropyltriethoxysilane) | Pierce | 80370 | |
ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse | Millipore Sigma | F3165 | |
Anti-Flag rabbit Antibody (polyclonal) | Millipore Sigma | F7425 | |
ATP 10 mM | Cell Signaling | 9804S | |
β-Glycerophosphate disodium salt hydrate | Millipore-Sigma | G9422 | |
bacteriological agar | VWR | 97064-336 | |
Blocking Buffer | ThermoFisher/Pierce | 37535 | |
Brij 35 | ThermoFisher/Pierce | BP345-500 | |
BS3 (bis-sulfosuccinimidyl) | ThermoFisher/Pierce | 21580 | |
BSA (bovine serum albumin) | Millipore Sigma | A2153 | |
Coverslip 24 x 60 mm | VWR | 48393-106 | |
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-165-150 | |
DeepWell Block, case of 50 | ThermoFisher/AbGene | AB-0661 | |
DEPC water | Ambion | 9906 | |
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Millipore-Sigma | D8418 | |
DNA-intercalating dye | Invitrogen | P11495 | |
DNase I | Millipore-Sigma | AMPD1-1KT | |
DTT | Millipore-Sigma | 43816 | |
EDTA | Millipore-Sigma | EDS | |
Ethanol 200 proof | Millipore-Sigma | E7023 | |
Filter plates | Millipore-Sigma | WHA77002804 | |
Gas Permeable Seals, box of 50 | ThermoFisher/AbGene | AB-0718 | |
Glass box | Wheaton | 900201 | |
Glass slides | VWR | 48300-047 | |
Glycerol | Millipore-Sigma | G5516 | |
HCl (Hydrochloric acid) | Millipore-Sigma | H1758 | |
HEPES Buffer Solution | Millipore-Sigma | 83264 | |
Human-based IVTT system | Thermo Scientific | 88882 | |
ImmunoPure Mouse IgG whole molecule | ThermoFisher/Pierce | 31202 | |
Isopropanol | Millipore-Sigma | I9516 | |
KCl (Potassium chloride) | Millipore-Sigma | P9333 | |
KH2PO4(Potassium phosphate monobasic) | Millipore-Sigma | P5655 | |
Kinase buffer | Cell Signaling | 9802 | |
KOAc (Potassium acetate) | Millipore-Sigma | P1190 | |
Lambda Protein Phosphatase | new england biolabs | P0753 | |
Lifterslips, 24 x 60 mm | ThermoFisher Scientific | 25X60I24789001LS | |
Metal 30-slide rack with no handles | Wheaton | 900234 | |
MgCL2 (Magnesium chloride) | Millipore-Sigma | M8266 | |
Na3VO4 (Sodium orthovanadate) | Millipore-Sigma | S6508 | |
NaCl (Sodium Chloride) | Millipore-Sigma | S3014 | |
NaOAc (Sodium acetate) | Millipore-Sigma | S2889 | |
NaOH (Sodium hydroxide) | Millipore-Sigma | S8045 | |
NucleoBond Xtra Midi / Maxi | Macherey-Nagel | 740410.10 / 740414.10 | |
Nucleoprep Anion II | Macherey Nagel | 740503.1 | |
Phosphoric Acid | Millipore-Sigma | 79617 | |
Poly-L-Lysine Solution (0.01%) | Millipore-Sigma | A-005-C | |
Protein Phosphatase (Lambda) | New England Biolabs | P0753 | |
RNAse | Invitrogen | 12091021 | |
SDS (Sodium dodecyl sulfate) | Millipore-Sigma | L6026 | |
SDS (Sodium dodecyl sulfate) | Millipore-Sigma | 05030 | |
Sealing gasket | Grace Bio-Labs, Inc | 44904 | |
Silica packets | VWR | 100489-246 | |
Single well plate | ThermoFisher/Nalge Nunc | 242811 | |
Sodium acetate (3M, pH 5.5) | Millipore-Sigma | 71196 | |
TB media (Terrific Broth) | Millipore-Sigma | T0918 | |
Tris | IBI scientific | IB70144 | |
Triton X-100 | Millipore-Sigma | T8787 | |
Tryptone | Millipore-Sigma | T7293 | |
Tween 20 | Millipore-Sigma | P9416 | |
Yeast Extract | Millipore-Sigma | Y1625 | |
Name | Company | Catalog number | Comments |
Equipments | Maker/model | ||
Programmable chilling incubator | Torrey Pines IN30 Incubator with Cooling | ||
Shaker for bacterial growth | ATR Multitron shaker | ||
Vacuum manifold with liquid waste trap | MultiScreenVacuum Manifold 96 well | ||
96 well autopippetor/liquid handler | Genmate or Biomek FX | ||
Liquid dispenser | Wellmate | ||
DNA microarrayer | Genetix QArray2 | ||
Automatic hybridization station | Tecan HS4800 Pro Hybridization Station | ||
Microarray scanner | Tecan PowerScanner | ||
Microarray data quantification | Tecan Array-ProAnalyzer 6.3 |