자동 이미지 처리를 사용하여 핵분열 및 신진 효모의 지질 방울 함량 분석
Summary
여기에서, 우리는 핵분열과 신진 효모 세포의 형광 현미경 심상에 있는 지질 방울의 자동적인 탐지 그리고 정량적인 설명의 MATLAB 구현을 제시합니다.
Abstract
지질 대사와 그 조절은 기본 및 응용 생명 과학 및 생명 공학 모두에 관심이 있습니다. 이와 관련하여, 다양한 효모 종은 지질 대사 연구 또는 산업 지질 생산의 모델로 사용된다. 지질 방울은 매우 동적인 저장 체이며, 그들의 세포 함량은 지질 대사 상태의 편리한 판독을 나타낸다. 형광 현미경 검사법은 널리 이용 가능한 장비에 의존하고 개별 지질 방울의 분석을 허용하기 때문에, 세포 지질 방울의 정량분석을 위한 선택의 방법입니다. 또한 현미경 이미지 분석을 자동화하여 전체 분석 처리량을 크게 높일 수 있습니다. 여기에서, 우리는 3개의 다른 모형 효모 종에 있는 개별 지질 방울의 자동적인 탐지 그리고 정량적인 설명을 위한 실험및 분석 워크플로우를 기술합니다: 분열 효모 Schizosaccharomyces pombe 및 Schizosaccharomyces japonicus,그리고 신진 효모 사카로마이세스 세레비시아. 지질 방울은 BODIPY 493/503으로 시각화되고, 세포 불투과성 형광 덱젠은 세포 경계를 식별하는 데 도움이 되는 배양 배지에 첨가된다. 세포는 녹색과 청색 채널에 있는 3D epifluorescence 현미경 검사법을 복종하고 생성된 z 스택 심자는 MATLAB 파이프라인에 의해 자동적으로 처리됩니다. 이 절차는 주요 스프레드시트 또는 통계 패키지의 다운스트림 분석에 적합한 표 형식으로 셀룰러 지질 액적 함량 및 개별 지질 액적 특성에 대한 풍부한 정량적 데이터를 출력합니다. 우리는 세포 지질 대사에 영향을 미치는 다양한 조건 하에서 지질 방울 함량의 예 분석을 제공합니다.
Introduction
지질세포 에너지와 탄소 대사, 막 성분 합성, 생리활성 물질 생산에 중요한 역할을 합니다. 지질 대사는 환경 조건, 영양소 가용성 및 세포 주기 단계1에 따라 미세 조정됩니다. 인간에서는, 지질 물질 대사는 비만, 타입 II 당뇨병 및암 2와 같은 질병에 연결되었습니다. 산업에서 효모와 같은 미생물에 의해 생성 된 지질은 재생 가능한 디젤 연료의 유망한 원천을 나타냅니다3. 세포는 소위 지질 방울에 중립 지질을 저장 (LDs). 이러한 진화적으로 보존된 바디는 트리아실글리세롤, 스테릴 에스테르, 외부 인지질 단층 및관련 단백질 1로 구성된다. LDs는 자 구 체 망상에서 유래, 세포 주기 또는 성장 단계 역학을 발휘, 세포 지질 항상성에 대 한 중요한1. LD 수 및 형태는 다양한 성장 조건 하에서 지질 대사를 또는 돌연변이의 패널을 스크리닝할 때 편리한 프록시로 사용될 수 있다. 그들의 동적 특성을 감안할 때, 개별 LDs의 특성을 분석 할 수있는 기술은 지질 대사의 연구에 특히 관심이 있습니다.
다양한 효모 종은 지질 관련 대사 경로 및 이들의 조절을 기술하기 위해 사용되어 왔으며, 또는 흥미로운 화합물 또는 연료를 생산하기 위해 생명 공학에 사용되어왔다1. 또한, 신진 효모 사카로마이세스 세레비시아 또는 원거리 관련 핵분열 효모 인 Schizosaccharomyces pombe,게놈 전체 결실 균주 라이브러리와 같은 모델 효모의 경우 높은 처리량에 사용할 수 있습니다. 화면4,5. 최근 LD 조성 및 역학은 S. pombe6,7,8,9,지질 대사와 관련된 돌연변이체가 신흥 모델 효모에서 분리되어 설명되어 왔다. Schizosaccharomyces japonicus10.
LD 함량과 역학을 연구하기 위해 다양한 기술을 사용할 수 있습니다. 대부분은 나일 레드 또는 BODIPY 493/503과 같은 친유성 염료를 가진 LDs의 얼룩의 어떤 종류를 채택합니다. 후자는 인지질(membranes)11과반대로 보다 좁은 여기 및 방출 스펙트럼, 및 중성 지질(LDs)을 향한 특이성을 증가시키는 것을 나타낸다. 형광및 유동세포측정법은 저장지질함량12,13,14,15에영향을 미치는 유전자 및 성장조건을 밝히기 위해 다양한 곰팡이종에 성공적으로 사용되어 왔다. 이 방법은 높은 처리량 응용프로그램에 적합하더라도, 성장 조건과 유전형 사이에서 극적으로 다를 수 있는 세포에 있는 개별 적인 LDs의 수 그리고 형태를 측정할 수 없습니다. 코히런트 라만 산란 또는 디지털 홀로그램 현미경 은 LD 수준의 데이터를 산출하는 라벨없는 방법이지만, 전문 고가의 장비16,17,18이필요합니다. 형광 현미경 검사법은, 다른 한편으로는, 일반적으로 이용 가능한 계기 및 심상 분석 소프트웨어 공구를 이용하는 동안, LD 내용에 상세한 데이터를 제공할 수 있습니다. 여러 분석 워크플로우가 존재하며 이미지 데이터에서 셀/LD 검출에서 다양한 수준의 정교함과 자동화를 특징으로 하며, 큰 LDs19,20을 가진 메타조안 셀과 같은 다양한 세포 유형에 최적화되어 있습니다. , 21, 또는 신진 효모17,22,23. 이러한 방법 중 일부는 2D(예: 최대 프로젝션 이미지)에서만 작동하며, 이는 셀룰러 LD 콘텐츠를 안정적으로 설명하지 못할 수 있습니다. 우리의 지식에, 분열 효모 현미경 데이터에서 LD 내용 그리고 형태학의 측정을 위한 아무 공구도 존재하지 않습니다. 자동화되고 강력한 LD-레벨 분석의 개발은 증가된 감도와 향상된 통계적 힘을 가져다 줄 것이며, 여러 효모 종에서 이상적으로 중성 지질 함량에 대한 풍부한 정보를 제공합니다.
우리는 효모 세포의 3D 형광 현미경 심상에서 LD 내용 분석을 위한 워크플로우를 개발했습니다. 살아있는 세포는 각각 LD를 시각화하고 세포 경계를 결정하기 위해 BODIPY 493/503 및 캐스케이드 블루 덱스터넨으로 염색됩니다. 세포는 유리 슬라이드에 고정되고 표준 epifluorescence 현미경을 사용하여 z 스택 화상 진찰을 행합니다. 그런 다음 통계 분석을 위해 널리 사용되는 (상업적) 패키지인 MATLAB에서 구현된 자동화된 파이프라인에 의해 이미지가 처리됩니다. 파이프라인은 이미지 전처리, 세분화(셀 대 배경, 죽은 셀 제거) 및 LD 식별을 수행합니다. 그런 다음 LD 크기 및 형광 강도와 같은 풍부한 LD 수준 데이터가 주요 스프레드시트 소프트웨어 도구와 호환되는 테이블 형식으로 제공됩니다. 이 워크플로우는 S. pombe24에서지질 대사에 대한 질소 공급원 가용성의 영향을 결정하는 데 성공적으로 사용되었다. 우리는 지금 세포 LD 내용에 영향을 미치는 성장 조건 또는 돌연변이를 사용하여 S. pombe, S. japonicus 및 S. cerevisiae에있는 워크플로우의 기능을 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
지질 대사와 그 조절에 대한 이해는 기본적인 생물학, 임상 및 생명 공학 응용 분야 모두에 중요합니다. LD 함량은 세포의 지질 대사 상태의 편리한 판독을 나타내며, 형광 현미경 검사법은 LD 함량 측정에 사용되는 주요 방법 중 하나이다. 제시된 프로토콜은 세 가지 상이하고 형태학적으로 구별되는 효모 종에서 개별 LDs의 자동 검출 및 정량적 설명을 허용합니다. 우리가 알고 있는 것은 핵분열 효…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 찰스 대학 보조금 PRIMUS / MED / 26, GAUK 1308217 및 SVV 260310에 의해 지원되었다. 우리는 현미경 검사법 및 이미지 분석 파이프 라인의 개발에 도움을 Ondřej Šebesta 감사합니다. 우리는 S. 세레비시아 균주에 대한 ReGenEx 실험실, 그리고 S. japonicus 균주에 대한 JapoNet과 히로노리 니키의 실험실에 감사드립니다. ppc1-88 균주는 효모 유전 자원 센터 일본에 의해 제공되었다. 현미경 검사법은 유럽 지역 개발 기금과 체코 공화국의 국가 예산에 의해 공동 으로 자금을 조달 공초점 및 형광 현미경 검사법의 실험실에서 수행되었다 (프로젝트 번호. CZ.1.05/4.1.00/16.0347 및 CZ.2.16/3.1.00/21515).
Materials
| 12-bit monochromatic CCD camera Hamamatsu ORCA C4742-80-12AG | Hamamatsu | or equivalent | |
| Adenine hemisulfate salt, ≥99% | Merck | A9126-25G | |
| BODIPY 493/503 (4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene) | Thermo Fisher Scientific | D3922 | for neutral lipid staining |
| D-(+) – Glucose, ≥99.5% | Merck | G7021 | |
| Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | Thermo Fisher Scientific | D1976 | for negative staining of cells |
| Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% | Merck | D4540 | or higher purity, keep anhydrous on molecular sieves |
| EMM broth without dextrose | Formedium | PMD0405 | medium may also be prepared from individual components |
| Fiji/ImageJ software | NIH | or equivalent; for visual inspection of microscopic data | |
| High precision cover glasses, 22×22 mm, No 1.5 | VWR | 630-2186 | use any # 1.5 cover glass |
| Image Processing Toolbox for MATLAB, version 10.0 | Mathworks | ||
| Lectin from Glycine max (soybean) | Merck | L1395 | for cell immobilization on slides |
| MATLAB software, version 9.2 | Mathworks | ||
| Microscope slide, 26 x 76 mm, 1 mm thickness | Knittel Glass | L762601.2 | use any microscope slide fitting your microscope stage, clean thoroughly before loading cells |
| Olympus CellR microscope with automatic z-axis objective movement | Olympus | or equivalent | |
| pentaband filter set | Semrock | F66-985 | brightfield, green and blue channels are sufficient |
| Signal Processing Toolbox for MATLAB, version 7.4 | Mathworks | ||
| SP supplements | Formedium | PSU0101 | |
| standard office computer capable of running MATLAB | |||
| Statistics and Machine Learning Toolbox for MATLAB, version 11.1 | Mathworks | ||
| Universal peptone M66 for microbiology | Merck | 1070431000 | |
| UPLSAPO 60XO objective | Olympus | or equivalent | |
| Yeast extract | Formedium | YEA03 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0405 |
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