Analys av lipidhalten i fission och spirande jästsvampar med automatiserad bildbehandling
Summary
Här presenterar vi en MATLAB implementering av automatiserad upptäckt och kvantitativ beskrivning av lipiddroppar i fluorescens mikroskopi bilder av fission och spirande jästceller.
Abstract
Lipidmetabolismen och dess reglering är av intresse för både grund-och tillämpad biovetenskap och bioteknik. I detta avseende, olika jästarter används som modeller i lipid metabolisk forskning eller för industriell lipidproduktion. Lipiddroppar är mycket dynamisk lagring organ och deras cellulära innehåll representerar en bekväm avläsning av lipidmetaboliska tillstånd. Fluorescensmikroskopi är en metod att välja för kvantitativ analys av cellulära lipiddroppar, eftersom den förlitar sig på allmänt tillgänglig utrustning och möjliggör analys av enskilda lipiddroppar. Dessutom kan mikroskopisk bildanalys automatiseras, kraftigt öka övergripande analys genomströmning. Här beskriver vi ett experimentellt och analytiskt arbetsflöde för automatiserad detektering och kvantitativ beskrivning av enskilda lipiddroppar i tre olika modell jästarter: fission jäst Schizosaccharomyces pombe och Schizosaccharomyces japonicus, och den spirande jästen Saccharomyces cerevisiae. Lipiddroppar visualiseras med BODIPY 493/503, och cell-impermeable fluorescerande dextran läggs till kulturen medierna att hjälpa till att identifiera cell gränser. Celler utsätts för 3D-epifluorescens-mikroskopi i gröna och blåa kanaler och de resulterande z-stackbilderna bearbetas automatiskt av en MATLAB-pipeline. Proceduren visar rika kvantitativa data om cellulär lipidinnehåll och enskilda lipiddroplet-egenskaper i tabellformat som lämpar sig för efterföljande analyser i större kalkylblads-eller statistiska paket. Vi tillhandahåller exempel analyser av lipidinnehåll under olika förhållanden som påverkar cellernas lipidmetabolism.
Introduction
Lipider spelar en avgörande roll i cellernas energi-och koldioxidmetabolism, syntes av membran komponenter och produktion av bioaktiva substanser. Lipid metabolism finjusteras enligt miljöförhållanden, näringsämnes tillgänglighet och cell-Cycle fas1. Hos människor, lipid metabolism har kopplats till sjukdomar, såsom fetma, typ II diabetes och cancer2. Inom industrin utgör lipider som produceras av mikroorganismer, såsom jästsvampar, en lovande källa till förnybara dieselbränslen3. Celler lagrar neutrala lipider i så kallade lipiddroppar (LDs). Dessa bevarade evolutionärt förkroppsligar komponeras av triacylglycerols, steryl estrar, en yttre fosfolipid enskiktslager och tillhörande proteiner1. LDs har sitt ursprung i endoplasmatiska Retikulum, utöva cell-Cycle eller tillväxt-fas dynamik, och är viktiga för cellulära lipid homeostas1. LD nummer och morfologi kan användas som en bekväm proxy när testmetoder lipid metabolism under olika tillväxtförhållanden eller när screening en panel av mutanter. Med tanke på deras dynamiska karaktär, tekniker som kan analysera egenskaperna hos enskilda LDs är av särskilt intresse i studier av lipidmetabolismen.
Olika jästarter har använts för att beskriva lipidrelaterade metaboliska vägar och deras reglering, eller används i bioteknik för att producera intressanta föreningar eller bränslen1. Dessutom, för modell jäst, såsom spirande jäst Saccharomyces cerevisiae eller avlägset relaterade fission jäst Schizosaccharomyces pombe, genomomfattande borttagning stam bibliotek finns tillgängliga som kan användas för hög genomströmning skärmar4,5. Nyligen LD sammansättning och dynamik har beskrivits i S. pombe6,7,8,9, och mutanter relaterade till lipidmetabolismen har isolerats i den framväxande modellen jäst Schizosaccharomyces japonicus10.
Det finns många tekniker för att studera LD-innehåll och dynamik. De flesta anställer någon form av färgning av LDs med lipofila färgämnen som Nile Red eller BODIPY 493/503. Den senare visar mer smala excitation och emission Spectra, och ökad specificitet mot neutrala lipider (LDs) i motsats till fosfolipider (membran)11. Fluorimetriska och flödescytometri metoder har använts framgångsrikt i olika svamparter att avslöja gener och tillväxtförhållanden som påverkar lagring lipidhalten12,13,14,15. Även om dessa metoder lämpar sig för tillämpningar med högt dataflöde kan de inte mäta antalet och morfologin hos enskilda LDs i celler, vilket kan skilja sig dramatiskt mellan tillväxtförhållanden och genotyper. Sammanhängande Raman spridning eller digital holografisk mikroskopi är etikettfria metoder som ger LD-nivå data, men kräver specialiserad dyr utrustning16,17,18. Fluorescens mikroskopi, å andra sidan, kan ge detaljerade uppgifter om LD innehåll, samtidigt som de använder allmänt tillgängliga instrument och bildanalys mjukvaruverktyg. Flera analys arbetsflöden finns som har olika grader av förfining och automatisering i cell/LD-detektering från bilddata, och är optimerade för olika celltyper, till exempel metazoan celler med stora LDs19,20 , 21, eller blivande jästsvampar17,22,23. Vissa av dessa metoder fungerar bara i 2D (t. ex. på maximala projektionsbilder), vilket kan undgå att tillförlitligt beskriva det cellulära LD-innehållet. Till vår kännedom, inga verktyg finns för bestämning av LD innehåll och morfologi från fission jäst mikroskopiska data. Utveckling av automatiserade och robusta LD-nivåanalyser skulle ge ökad känslighet och ökad statistisk kraft, och ge rik information om neutralt lipidinnehåll, helst i flera jästarter.
Vi har utvecklat ett arbetsflöde för LD innehållsanalys från 3D fluorescens mikroskopi bilder av jästceller. Levande celler färgas med BODIPY 493/503 och Cascade Blue dextran att visualisera LDs och bestämma cell gränser, respektive. Cellerna är immobiliserade på glas rutschbanor och utsätts för z-stack Imaging med hjälp av ett standard epifluorescensmikroskopi Mikroskop. Bilderna bearbetas sedan av en automatiserad pipeline som implementeras i MATLAB, ett allmänt använt (kommersiellt) paket för statistiska analyser. Pipelinen utför bildförbehandling, segmentering (celler kontra bakgrund, borttagning av döda celler) och LD-identifiering. Rich LD-nivådata, som LD-storlek och fluorescensintensitet, tillhandahålls sedan i ett tabellformat som är kompatibelt med större kalkylbladsverktyg. Arbetsflödet har använts framgångsrikt för att bestämma effekten av kvävekälla tillgänglighet på lipidmetabolismen i S. pombe24. Vi visar nu funktionaliteten i arbetsflödet i s. pombe, s. japonicus och s. cerevisiae, med hjälp av tillväxtvillkor eller mutanter som påverkar cellulära LD innehåll.
Protocol
Representative Results
Discussion
Förståelsen av lipidmetabolismen och dess reglering är viktig för både grundläggande biologi, och kliniska och bioteknologiska tillämpningar. LD innehåll utgör en bekväm avläsning av lipidmetabolismen tillståndet i cellen, med fluorescens mikroskopi är en av de viktigaste metoderna som används för LD innehåll bestämning. Det presenterade protokollet möjliggör automatisk detektering och kvantitativ beskrivning av enskilda LDs i tre olika och morfologiskt distinkta jästarter. Till vår kännedom finns i…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Charles University Grants PRIMUS/MED/26, GAUK 1308217 och SVV 260310. Vi tackar Ondřej ŠEBESTA för hjälp med mikroskopi och utveckling av bilden analyspipeline. Vi tackar ReGenEx Lab för s. cerevisiae stammar, och Japonet och Hironori Niki ‘ s Lab för s. japonicus stammar. Den ppc1-88 stammen tillhandahölls av jästen genetiska resurs Center Japan. Mikroskopi utfördes i laboratoriet av Konfokal och fluorescens mikroskopi medfinansierat av Europeiska regionala utvecklingsfonden och Tjeckiens statsbudget (Projektnr. CZ. 1.05/4.1.00/16.0347 och CZ. 2.16/3.1.00/21515).
Materials
| 12-bit monochromatic CCD camera Hamamatsu ORCA C4742-80-12AG | Hamamatsu | or equivalent | |
| Adenine hemisulfate salt, ≥99% | Merck | A9126-25G | |
| BODIPY 493/503 (4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene) | Thermo Fisher Scientific | D3922 | for neutral lipid staining |
| D-(+) – Glucose, ≥99.5% | Merck | G7021 | |
| Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | Thermo Fisher Scientific | D1976 | for negative staining of cells |
| Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% | Merck | D4540 | or higher purity, keep anhydrous on molecular sieves |
| EMM broth without dextrose | Formedium | PMD0405 | medium may also be prepared from individual components |
| Fiji/ImageJ software | NIH | or equivalent; for visual inspection of microscopic data | |
| High precision cover glasses, 22×22 mm, No 1.5 | VWR | 630-2186 | use any # 1.5 cover glass |
| Image Processing Toolbox for MATLAB, version 10.0 | Mathworks | ||
| Lectin from Glycine max (soybean) | Merck | L1395 | for cell immobilization on slides |
| MATLAB software, version 9.2 | Mathworks | ||
| Microscope slide, 26 x 76 mm, 1 mm thickness | Knittel Glass | L762601.2 | use any microscope slide fitting your microscope stage, clean thoroughly before loading cells |
| Olympus CellR microscope with automatic z-axis objective movement | Olympus | or equivalent | |
| pentaband filter set | Semrock | F66-985 | brightfield, green and blue channels are sufficient |
| Signal Processing Toolbox for MATLAB, version 7.4 | Mathworks | ||
| SP supplements | Formedium | PSU0101 | |
| standard office computer capable of running MATLAB | |||
| Statistics and Machine Learning Toolbox for MATLAB, version 11.1 | Mathworks | ||
| Universal peptone M66 for microbiology | Merck | 1070431000 | |
| UPLSAPO 60XO objective | Olympus | or equivalent | |
| Yeast extract | Formedium | YEA03 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0405 |
References
- Koch, B., Schmidt, C., Daum, G. Storage lipids of yeasts: a survey of nonpolar lipid metabolism in Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, and Yarrowia lipolytica. FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 892-915 (2014).
- Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. Balancing the fat: lipid droplets and human disease. EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).
- Lazar, Z., Liu, N., Stephanopoulos, G. Holistic Approaches in Lipid Production by Yarrowia lipolytica. Trends in Biotechnology. 36 (11), 1157-1170 (2018).
- Kim, D. U., et al. Analysis of a genome-wide set of gene deletions in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Nature Biotechnology. 28 (6), 1628-1629 (2010).
- Giaever, G., Nislow, C. The yeast deletion collection: a decade of functional genomics. Génétique. 197 (2), 451-465 (2014).
- Meyers, A., et al. The protein and neutral lipid composition of lipid droplets isolated from the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe. Journal of Microbiology (Seoul, Korea). 55 (2), 112-122 (2017).
- Meyers, A., et al. Lipid Droplets Form from Distinct Regions of the Cell in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe. Traffic (Copenhagen, Denmark). 17 (6), 657-659 (2016).
- Long, A. P., et al. Lipid droplet de novo formation and fission are linked to the cell cycle in fission yeast. Traffic (Copenhagen, Denmark). 13 (5), 705-714 (2012).
- Yang, H. J., Osakada, H., Kojidani, T., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. Lipid droplet dynamics during Schizosaccharomyces pombe sporulation and their role in spore survival. Biology Open. , 8 (2016).
- Aoki, K., Shiwa, Y., Takada, H., Yoshikawa, H., Niki, H. Regulation of nuclear envelope dynamics via APC/C is necessary for the progression of semi-open mitosis in Schizosaccharomyces japonicus. Genes To Cells: Devoted To Molecular & Cellular Mechanisms. 18 (9), 733-752 (2013).
- Karolin, J., Johansson, L. B. A., Strandberg, L., Ny, T. Fluorescence and Absorption Spectroscopic Properties of Dipyrrometheneboron Difluoride (BODIPY) Derivatives in Liquids, Lipid Membranes, and Proteins. Journal of the American Chemical Society. 116 (17), 7801-7806 (1994).
- Bozaquel-Morais, B. L., Madeira, J. B., Maya-Monteiro, C. M., Masuda, C. A., Montero-Lomeli, M. A new fluorescence-based method identifies protein phosphatases regulating lipid droplet metabolism. PloS One. 5 (10), e13692 (2010).
- Sitepu, I. R., et al. An improved high-throughput Nile red fluorescence assay for estimating intracellular lipids in a variety of yeast species. Journal of Microbiological Methods. 91 (2), 321-328 (2012).
- Rostron, K. A., Lawrence, C. L. Nile Red Staining of Neutral Lipids in Yeast. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1560, 219-229 (2017).
- Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli, M., Pardo, J. P., Guerra-Sánchez, G. Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis. Journal of Visualized Experiments. (134), 1-6 (2018).
- Gupta, A., Dorlhiac, G. F., Streets, A. M. Quantitative imaging of lipid droplets in single cells. The Analyst. , (2018).
- Wolinski, H., Bredies, K., Kohlwein, S. D. Quantitative imaging of lipid metabolism in yeast: from 4D analysis to high content screens of mutant libraries. Methods in Cell Biology. , 108-365 (2012).
- Campos, V., Rappaz, B., Kuttler, F., Turcatti, G., Naveiras, O. High-throughput, nonperturbing quantification of lipid droplets with digital holographic microscopy. Journal of Lipid Research. 59 (7), 1301-1310 (2018).
- Ranall, M. V., Gabrielli, B. G., Gonda, T. J. High-content imaging of neutral lipid droplets with 1,6-diphenylhexatriene. BioTechniques. 51 (1), 35-42 (2011).
- Schnitzler, J. G., et al. Nile Red Quantifier: a novel and quantitative tool to study lipid accumulation in patient-derived circulating monocytes using confocal microscopy. Journal of Lipid Research. 58 (11), 2210-2219 (2017).
- Bombrun, M., Gao, H., Ranefall, P., Mejhert, N., Arner, P., Wählby, C. Quantitative high-content/high-throughput microscopy analysis of lipid droplets in subject-specific adipogenesis models. Cytometry. Part A the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (11), 1068-1077 (2017).
- Capus, A., Monnerat, M., Ribeiro, L. C., de Souza, W., Martins, J. L., Sant’Anna, C. Application of high-content image analysis for quantitatively estimating lipid accumulation in oleaginous yeasts with potential for use in biodiesel production. Bioresource Technology. 203, 309-317 (2016).
- Lv, X., et al. Identification of gene products that control lipid droplet size in yeast using a high-throughput quantitative image analysis. Biochimica et biophysica acta. Molecular and Cell Biology Of Lipids. 1864 (2), 113-127 (2018).
- Zach, R., Tvarůžková, J., Schätz, M., Ťupa, O., Grallert, B., Převorovský, M. Mitotic defects in fission yeast lipid metabolism “cut” mutants are suppressed by ammonium chloride. FEMS Yeast Research. 18 (6), 1-7 (2018).
- Petersen, J., Russell, P. Growth and the Environment of Schizosaccharomyces pombe. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (3), (2016).
- Aoki, K., Furuya, K., Niki, H. Schizosaccharomyces japonicus: A Distinct Dimorphic Yeast among the Fission Yeasts. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2017).
- Curran, B. P. G., Bugeja, V. Basic investigations in Saccharomyces cerevisiae. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). , 1-14 (2014).
- Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. Molecular genetics of Schizosaccharomyces pombe. Methods in Enzymology. 470 (10), 759-795 (2010).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Nakamura, T., Pluskal, T., Nakaseko, Y., Yanagida, M. Impaired coenzyme A synthesis in fission yeast causes defective mitosis, quiescence-exit failure, histone hypoacetylation and fragile DNA. Open Biology. 2 (9), 120117 (2012).
- Furuya, K., Niki, H. Isolation of heterothallic haploid and auxotrophic mutants of Schizosaccharomyces japonicus. Yeast. 26 (4), 221-233 (2009).
- Ivnitski-Steele, I., et al. Identification of Nile red as a fluorescent substrate of the Candida albicans ATP-binding cassette transporters Cdr1p and Cdr2p and the major facilitator superfamily transporter Mdr1p. Analytical Biochemistry. 394 (1), 87-91 (2009).
- Wolinski, H., Kohlwein, S. D. Microscopic analysis of lipid droplet metabolism and dynamics in yeast. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 457 (1), 151-163 (2008).
- Graml, V., et al. A genomic Multiprocess survey of machineries that control and link cell shape, microtubule organization, and cell-cycle progression. Developmental Cell. 31 (2), 227-239 (2014).
