마우스 횡문근에서 분리 된 원발성 종양 세포에서 종양 구체 유도 및 치료
Summary
이 프로토콜은 마우스 횡문근 육종 1차 세포의 분리, 종양구 형성 및 치료, 및 종양구배양으로부터 시작되는 동종 이식이식에 대한 재현가능한 방법을 설명한다.
Abstract
횡문근육종 (RMS)은 어린이에게 가장 흔한 연조직 육종입니다. 상당한 노력이 RMS와 관련되었던 일반적인 돌연변이의 확인을 가능하게 하고 다른 RMS 특수형의 차별을 허용했더라도, 중요한 도전은 예후를 더 향상시키기 위하여 새로운 처리의 발달을 위해 아직도 존재합니다. myogenic 마커의 발현에 의해 확인되더라도, 기원의 세포가 아직도 제대로 이해되지 않는 때문에 RMS가 myogenic 또는 비 myogenic 기원이 있는지 여부에 대한 중요한 논쟁이 아직도 있습니다. 본 연구에서는, 마우스 RMS에 대한 종양구법 분석법에 대해 신뢰할 수 있는 방법이 제공된다. 분석법은 종양 세포의 기능적 특성에 기초하고 종양 성 기능을 가진 종양에 있는 희소한 인구의 확인을 허용합니다. 또한 재조합 단백질을 테스트하고, 형질전환 프로토콜을 종양 권 분석실험과 통합하고, 종양 발달 및 성장에 관여하는 후보 유전자를 평가하기 위한 절차도 기술되어 있다. 추가로 기재된 종양이식이식은 생체내에서종양발생 기능을 검증하기 위해 수용자 마우스로 이식하는 절차이다. 전반적으로, 기술된 방법은 다른 문맥에서 발생하는 RMS에 적용될 수 있는 희소한 RMS 종양성 집단의 신뢰할 수 있는 식별 및 시험을 허용한다. 마지막으로, 프로토콜은 약물 스크리닝 및 치료제의 향후 개발을 위한 플랫폼으로 활용될 수 있다.
Introduction
암은 이질적인 질병입니다. 게다가, 종양의 동일 모형은 다른 환자에 있는 다른 유전 돌연변이를 제출할 수 있고, 환자 내의 종양은 세포의 다중 인구에 의해 구성됩니다1. 이질성은 암을 시작하고 전파하는 세포의 식별에 도전을 제시합니다, 그러나 그들의 특성은 능률적인 처리의 발달을 위해 필수적입니다. 종양 발달에 기여하는 세포의 희소한 인구인 종양 전파 세포 (TPC)의 개념은 이전에 광범위하게 검토되었습니다2. TPC가 여러 유형의 암을 특징으로한다는 사실에도 불구하고, 신뢰할 수있는 격리를위한 마커의 식별은 여러 종양 유형3,4,5및6에 대한 도전으로 남아 있습니다. , 7명 , 8개 , 따라서,분자 마커에 의존하지 않고 오히려 TPC 기능적 특성 (높은 자기 재생 및 낮은 부착 조건에서 성장하는 능력)에 의존하지 않는 방법, 종양 권 형성 분석법으로 알려진, 널리 적용 될 수있다 대부분의 종양에서 TPC의 식별. 중요한 것은, 이러한 분석또한 TPC의 확장을 위해 사용될 수 있으며, 따라서 암 내성1,10에대한 암 약물 스크리닝 및 연구에 직접 적용될 수 있다.
Rhabdomyo육종 (RMS)은 어린 아이들(11)에서가장 흔한 연조직 육종의 드문 형태입니다. Althoug RMS는 근생 마커의 발현의 평가를 통해 조직학적으로 확인될 수 있으며, 기원의 RMS 세포는 종양 발달 자극의 다중 종양 아류형 및 높은 이질성으로 인해 단명하게 특징지어지지 않았다. 실제로, 최근 연구는 RMS가 근생 또는 비 myogenic 기원인지에 대한 중요한 과학적 토론을 생성했다, RMS는 컨텍스트에 따라 다른 세포 유형에서 파생 될 수 있음을 시사12,13, 14세 , 15세 , 16세 , 17. RMS 세포주에 대한 수많은 연구는 종양 발달에 관여하는 경로의 식별과 높은 자기 갱신 인구와 관련된 마커의 특성화에 대한 종양 권 형성 분석을 사용하여 수행되었습니다. 18세 , 19세 , 20개 , 21.
그러나, 기원의 RMS 세포를 확인하기 위한 종양구 형성 분석법의 잠재력에도 불구하고, 1차 RMS 세포에 사용될 수 있는 신뢰할 수 있는 방법은 아직 기술되지 않았다. 이러한 맥락에서, 우리 그룹으로부터의 최근 연구는 듀첸 근이영양증(DMD) 마우스모델(22)에서기원의 RMS 세포의 식별을 위한 최적화된 종양권 형성 분석기를 채택하였다. 근육 조직에서 분리된 여러 개의 종양 전 세포 유형은 부착이 낮은 조건에서 성장하는 능력에 대해 테스트되어 영양 실맥에서 RMS의 기원 세포로 근육 줄기 세포를 식별할 수 있습니다. 여기서 설명된 것은 마우스 RMS 발달을 담당하는 극히 드문 세포 집단의 식별을 위해 성공적으로 채택된 종양구 형성분석(그림 1)에대한 재현가능하고 신뢰할 수 있는 프로토콜이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
종양 이질성 세포 집단으로부터의 TPC의 격리 및 특성화: 종양 투종 분석법, FACS 격리 및 종양구 형성 분석법에서 여러 가지 방법이 채택되었다. 종양 투동성 분석은 1971년에 처음 기술되었으며, 줄기 세포 연구에 사용되었으며, 이후 암 생물학29,30에만적용되었다. 이 방법은 연겔배양물(31)에서제약 없이 확장되는 암 줄기세포 본질적 성…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 엘리슨 의료 재단 보조금 AG-NS-0843-11, 그리고 NCI 암 센터 지원 교부금 P30CA030199 A.S. 내에서 NIH 파일럿 교부금에 의해 지원되었다.
Materials
| Accutase cell dissociation reagent | Gibco | A1110501 | Detach adherent cells and dissociate tumorspheres |
| Celigo | Nexcelom | Celigo | Microwell plate based image cytometer for adherent and suspension cells |
| Collagenase, Type II | Life Technologies | 17101015 | Tissue digestion enzyme |
| Dispase II, protease | Life Technologies | 17105041 | Tissue digestion enzyme |
| DMEM high glucose media | Gibco | 11965092 | Component of tumor cells media |
| DMEM/F12 Media | Gibco | 11320033 | Component of tumosphere media |
| EDTA | ThermoFisher | S312500 | Component of FACS buffer |
| EGF recombinant mouse protein | Gibco | PMG8041 | Component of tumosphere media |
| FACSAria II Flow Cytometry | BD Biosciences | 650033 | Fluorescent activated cell sorter |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-11 | Component of tumor cells media |
| Fluriso (Isofluornae) anesthetic agent | MWI Vet Supply | 502017 | Anesthetic reagent for animals |
| FxCycle Violet Stain | Life Technologies | F10347 | Discriminate live and dead cells |
| Goat Serum | Life Technologies | 16210072 | Component of FACS buffer |
| Ham's F10 Media | Life Technologies | 11550043 | Component of FACS buffer |
| Horse Serum | Life Technologies | 16050114 | Component of cell isolation media |
| Lipofectamine 3000 transfection reagent | ThermoFisher | L3000015 | Transfection Reagent |
| Matrigel membrane matrix | Corning | CB40234 | Provides support to trasplanted cells |
| N-2 Supplemtns (100X) | Gibco | 17502048 | Component of tumosphere media |
| Neomycin-Polymyxin B Sulfates-Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment | MWI Vet Supply | 701008 | Eyes ointment |
| PBS | Gibco | 10010023 | Component of FACS buffer and used for washing cells |
| pEGFP-C1 | Addgene | 6084-1 | GFP plasmid |
| Penicillin – Streptomyocin | Life Technologies | 15140163 | Component of tumosphere and tumor cells media |
| Recombinant Human βFGF-basic | Peprotech | 10018B | Component of tumosphere media |
| Recombinant mouse Flt-3 Ligand Protein | R&D Systems | 427-FL-005 | Recombinant protein |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | Discriminate live and dead cells |
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