Denne protokollen beskriver en reproduserbar metode for isolering av mus rhabdomyosarcoma primære celler, tumorsphere dannelse og behandling, og allograft transplantasjon fra tumorspheres kulturer.
Rhabdomyosarcoma (RMS) er den vanligste bløtvevet sarkom hos barn. Selv om betydelig innsats har aktivert identifisering av vanlige mutasjoner knyttet til RMS og tillot diskriminering av ulike RMS undergrupper, store utfordringer fortsatt eksisterer for utvikling av romanen behandlinger for å ytterligere forbedre prognosen. Selv identifisert av uttrykk for myogenic markører, er det fortsatt betydelig uenighet om RMS har myogenic eller ikke-myogenic opprinnelse, som cellen av opprinnelse er fortsatt dårlig forstått. I denne studien, en pålitelig metode er gitt for tumorsphere analysen for mus RMS. Analysen er basert på funksjonelle egenskaper av tumorceller og tillater identifisering av sjeldne populasjoner i tumor med tumorigene funksjoner. Også beskrevet er prosedyrer for å teste rekombinant proteiner, integrere transfeksjoner protokoller med tumorsphere analysen, og evaluere kandidat gener involvert i tumor utvikling og vekst. Beskrevet videre er en prosedyre for allograft transplantasjon av tumorspheres i mottaker mus for å validere tumorigene funksjon in vivo. Samlet, den beskrevne metoden gir pålitelig identifisering og testing av sjeldne RMS tumorigene populasjoner som kan brukes til RMS som oppstår i ulike sammenhenger. Endelig kan protokollen benyttes som en plattform for narkotika screening og fremtidig utvikling av legemiddel.
Kreft er en heterogen sykdom; Videre kan samme type svulst presentere ulike genetiske mutasjoner i ulike pasienter, og innenfor en pasient en svulst er sammensatt av flere populasjoner av celler1. Heterogenitet presenterer en utfordring i identifisering av celler ansvarlig for initiering og spre kreft, men deres karakterisering er avgjørende for utviklingen av effektive behandlinger. Oppfatningen av tumor spre celler (TPC), en sjelden befolkning av celler som bidrar til tumor utvikling, har vært tidligere grundig gjennomgått2. Til tross for det faktum at TPCs har vært preget i flere typer kreft, er identifisering av markører for deres pålitelig isolasjon en utfordring for flere tumor typer3,4,5,6 , 7 andre er , 8 på alle , 9. således, en metode som ikke er avhengig av molekylære markører, men heller på TPC funksjonelle egenskaper (høy selv-fornyelse og evnen til å vokse i lav-vedlegg forhold), kjent som tumorsphere formasjon analysen, kan bli mye brukt for identifisering av TPCs fra de fleste svulster. Viktigere, kan denne analysen også være ansatt for utvidelse av TPCs og dermed direkte brukt til kreft narkotika screening og studier på kreft resistens1,10.
Rhabdomyosarcoma (RMS) er en sjelden form for bløtvev sarkom mest vanlig i små barn11. Promodell RMS kan histologisk identifisert gjennom vurdering av uttrykk for myogenic markører, RMS-cellen av opprinnelse har ikke blitt univocally preget på grunn av flere tumor undergrupper og høy heterogenitet av tumor utviklingsmessige stimuli. Faktisk har nyere studier generert betydelige vitenskapelige diskusjonen om RMS er av myogenic eller ikke-myogenic opprinnelse, noe som tyder på at RMS kan utledes fra ulike celler typer avhengig av sammenhengen12,13, 14 priser og priser , 15 priser og , 16 flere , 17. Tallrike studier på RMS cellelinjer har blitt utført ansette tumorsphere formasjon analysen for identifisering av trasé involvert i tumor utvikling og karakterisering av markører forbundet med svært selv-fornyelse populasjoner 18 av år , 19 andre priser , 20 priser og , 21i denne.
Men til tross for tumorsphere dannelse analysen potensial for å identifisere RMS celler opprinnelse, en pålitelig metode som kan brukes på primære RMS celler har ennå ikke blitt beskrevet. I denne sammenheng, en fersk studie fra vår gruppe ansatt en optimalisert tumorsphere formasjon analysen for identifisering av RMS-cellene opprinnelse i en Duchenne muskuløse dystrofi (DMD) mus modell22. Flere pre-tumorigene celletyper, isolert fra muskel vev, er testet for deres evne til å vokse i lav-vedlegg forhold, slik at identifisering av muskel stamceller som Opprinnelses celler for RMS i dystrophic sammenhenger. Beskrevet her er en reproduserbar og pålitelig protokoll for tumorsphere formasjon analysen (figur 1), som har blitt ansatt for identifisering av ekstremt sjeldne celle populasjoner som er ansvarlig for musen RMS utvikling.
Flere metoder har vært ansatt for isolasjon og karakterisering av TPCs fra tumor heterogene celle populasjoner: tumor clonogenic analyser, FACS isolasjon, og tumorsphere dannelse analysen. Svulsten clonogenic analysen ble først beskrevet i 1971, brukes for stilk cellen studier, og bare senere brukes til kreft biologi29,30. Denne metoden er basert på kreft stamceller iboende eiendom for å utvide uten begrensninger i myke gels kulturer31…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Ellison Medical Foundation stipend AG-NS-0843-11, og NIH pilot Grant innenfor NCI Cancer Center support Grant P30CA030199 til A.S.
Accutase cell dissociation reagent | Gibco | A1110501 | Detach adherent cells and dissociate tumorspheres |
Celigo | Nexcelom | Celigo | Microwell plate based image cytometer for adherent and suspension cells |
Collagenase, Type II | Life Technologies | 17101015 | Tissue digestion enzyme |
Dispase II, protease | Life Technologies | 17105041 | Tissue digestion enzyme |
DMEM high glucose media | Gibco | 11965092 | Component of tumor cells media |
DMEM/F12 Media | Gibco | 11320033 | Component of tumosphere media |
EDTA | ThermoFisher | S312500 | Component of FACS buffer |
EGF recombinant mouse protein | Gibco | PMG8041 | Component of tumosphere media |
FACSAria II Flow Cytometry | BD Biosciences | 650033 | Fluorescent activated cell sorter |
Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-11 | Component of tumor cells media |
Fluriso (Isofluornae) anesthetic agent | MWI Vet Supply | 502017 | Anesthetic reagent for animals |
FxCycle Violet Stain | Life Technologies | F10347 | Discriminate live and dead cells |
Goat Serum | Life Technologies | 16210072 | Component of FACS buffer |
Ham's F10 Media | Life Technologies | 11550043 | Component of FACS buffer |
Horse Serum | Life Technologies | 16050114 | Component of cell isolation media |
Lipofectamine 3000 transfection reagent | ThermoFisher | L3000015 | Transfection Reagent |
Matrigel membrane matrix | Corning | CB40234 | Provides support to trasplanted cells |
N-2 Supplemtns (100X) | Gibco | 17502048 | Component of tumosphere media |
Neomycin-Polymyxin B Sulfates-Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment | MWI Vet Supply | 701008 | Eyes ointment |
PBS | Gibco | 10010023 | Component of FACS buffer and used for washing cells |
pEGFP-C1 | Addgene | 6084-1 | GFP plasmid |
Penicillin – Streptomyocin | Life Technologies | 15140163 | Component of tumosphere and tumor cells media |
Recombinant Human βFGF-basic | Peprotech | 10018B | Component of tumosphere media |
Recombinant mouse Flt-3 Ligand Protein | R&D Systems | 427-FL-005 | Recombinant protein |
Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | Discriminate live and dead cells |