Опухолевая сфера произвлечения и лечения из первичных опухолевых клеток, изолированных от мыши Rhabdomyosarcomas
Summary
Этот протокол описывает воспроизводимый метод для изоляции мышей рабдомиосаркомы первичных клеток, формирования опухолевой сферы и лечения, и аллотрансплантата трансплантации, начиная с опухолевых культур.
Abstract
Рабдомиосаркома (RMS) является наиболее распространенной саркомой мягких тканей у детей. Хотя значительные усилия позволили выявить общие мутации, связанные с RMS и позволили дискриминации различных подтипов RMS, основные проблемы по-прежнему существуют для разработки новых методов лечения для дальнейшего улучшения прогноза. Хотя определены выражения миогенных маркеров, по-прежнему значительные споры по поводу того, RMS имеет миогенное или немиогенное происхождение, как клетка происхождения по-прежнему плохо понимается. В настоящем исследовании, надежный метод предусмотрен для опухолевого исследования для мыши RMS. Ассеи основан на функциональных свойствах опухолевых клеток и позволяет выявлять редкие популяции в опухоли с опухолевыми функциями. Также описаны процедуры тестирования рекомбинантных белков, интеграция протоколов трансфекции с анализом опухолевой сферы и оценка генов-кандидатов, участвующих в развитии и росте опухоли. Описано далее процедура для аллотрансплантата трансплантации опухолевых сфер в реципиентных мышей для проверки опухолевой функции in vivo. В целом, описанный метод позволяет надежно идентифицировать и тестировать редкие опухолевые популяции RMS, которые могут быть применены к RMS, возникающим в различных контекстах. Наконец, протокол может быть использован в качестве платформы для скрининга лекарственных средств и дальнейшего развития терапии.
Introduction
Рак является неоднородным заболеванием; кроме того, один и тот же тип опухоли может представлять различные генетические мутации у разных пациентов, и в пределах пациента опухоль состоит из нескольких популяций клеток1. Гетерогения представляет собой проблему в выявлении клеток, ответственных за инициацию и распространение рака, но их характеристика имеет важное значение для развития эффективных методов лечения. Понятие опухолевых клеток( размножающихся (TPC), редкая популяция клеток, которые способствуют развитию опухоли, ранее широко рассмотрены2. Несмотря на то, что ТЦ характеризовались несколькими видами рака, выявление маркеров для их надежной изоляции остается проблемой для нескольких типов опухолей3,4,5,6 , 7 (г. , 8 , 9. Таким образом, метод, который не опирается на молекулярные маркеры, а скорее на функциональные свойства TPC (высокое самообновление и способность расти в условиях низкой привязанности), известный как анализ формирования опухолевой сферы, может быть широко применен для идентификация ТЦ от большинства опухолей. Важно отметить, что этот анализ также может быть использован для расширения ТЦ и, таким образом, непосредственно применяется к скринингу рака наркотиков и исследований по устойчивости к раку1,10.
Рабдомиосаркома (RMS) является редкой формой саркомы мягких тканей, наиболее распространенной у маленьких детей11. Althoug RMS может быть гистологически определены путем оценки экспрессии миогенных маркеров, RMS ячейки происхождения не была однозначно характеризуется из-за нескольких подтипов опухоли и высокой неоднородности стимулов развития опухоли. Действительно, недавние исследования вызвали значительную научную дискуссию о том, RMS имеет миогенное или немиогенное происхождение, предполагая, что RMS может вытекать из различных типов клеток в зависимости от контекста12,13, 14 Год , 15 лет , 16 Год , 17. Многочисленные исследования на линиях клетки RMS были выполнены используя ассецию образования tumorsphere для идентификации путей, участвующих в развитии опухоли и характеристики маркеров, связанных с высоко самообновляющимися популяциями 18 лет , 19 лет , 20 , 21.
Однако, несмотря на потенциал формирования опухолевой сферы для выявления RMS-клеток происхождения, надежный метод, который может быть использован на первичных клетках RMS еще не описан. В этом контексте, недавнее исследование от нашей группы использовали оптимизированные опухолевые формирования исследования для идентификации RMS клеток происхождения в мышечной дистрофии Дюшенна (DMD) мыши модели22. Несколько типов предопухолевых клеток, изолированных от мышечных тканей, проверяются на их способность расти в условиях низкой привязанности, что позволяет идентифицировать мышечные стволовые клетки как клетки происхождения для RMS в дистрофических контекстах. Описанный здесь воспроизводимый и надежный протокол для оценки формирования опухоли(рисунок 1),который был успешно использован для идентификации крайне редких популяций клеток, которые отвечают за развитие мыши RMS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Для изоляции и характеристики ТЦ из опухолевых неоднородных клеточных популяций применялись многочисленные методы: клоногенные анализы опухолей, изоляция FACS и анализ формирования опухолевой сферы. Клоногенный ассеия опухоли была впервые описана в 1971 году, используется для исследова…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Эллисон Медицинский фонд грант AG-NS-0843-11, и NIH Пилот грант в рамках NCI онкологический центр Поддержка Грант P30CA030199 в А.С.
Materials
| Accutase cell dissociation reagent | Gibco | A1110501 | Detach adherent cells and dissociate tumorspheres |
| Celigo | Nexcelom | Celigo | Microwell plate based image cytometer for adherent and suspension cells |
| Collagenase, Type II | Life Technologies | 17101015 | Tissue digestion enzyme |
| Dispase II, protease | Life Technologies | 17105041 | Tissue digestion enzyme |
| DMEM high glucose media | Gibco | 11965092 | Component of tumor cells media |
| DMEM/F12 Media | Gibco | 11320033 | Component of tumosphere media |
| EDTA | ThermoFisher | S312500 | Component of FACS buffer |
| EGF recombinant mouse protein | Gibco | PMG8041 | Component of tumosphere media |
| FACSAria II Flow Cytometry | BD Biosciences | 650033 | Fluorescent activated cell sorter |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-11 | Component of tumor cells media |
| Fluriso (Isofluornae) anesthetic agent | MWI Vet Supply | 502017 | Anesthetic reagent for animals |
| FxCycle Violet Stain | Life Technologies | F10347 | Discriminate live and dead cells |
| Goat Serum | Life Technologies | 16210072 | Component of FACS buffer |
| Ham's F10 Media | Life Technologies | 11550043 | Component of FACS buffer |
| Horse Serum | Life Technologies | 16050114 | Component of cell isolation media |
| Lipofectamine 3000 transfection reagent | ThermoFisher | L3000015 | Transfection Reagent |
| Matrigel membrane matrix | Corning | CB40234 | Provides support to trasplanted cells |
| N-2 Supplemtns (100X) | Gibco | 17502048 | Component of tumosphere media |
| Neomycin-Polymyxin B Sulfates-Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment | MWI Vet Supply | 701008 | Eyes ointment |
| PBS | Gibco | 10010023 | Component of FACS buffer and used for washing cells |
| pEGFP-C1 | Addgene | 6084-1 | GFP plasmid |
| Penicillin – Streptomyocin | Life Technologies | 15140163 | Component of tumosphere and tumor cells media |
| Recombinant Human βFGF-basic | Peprotech | 10018B | Component of tumosphere media |
| Recombinant mouse Flt-3 Ligand Protein | R&D Systems | 427-FL-005 | Recombinant protein |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | Discriminate live and dead cells |
References
- Dagogo-Jack, I., Shaw, A. T. Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (2), 81-94 (2018).
- Wicha, M. S., Liu, S., Dontu, G. Cancer stem cells: an old idea–a paradigm shift. Recherche en cancérologie. 66 (4), 1883-1890 (2006).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Oishi, N., Yamashita, T., Kaneko, S. Molecular biology of liver cancer stem cells. Liver Cancer. 3 (2), 71-84 (2014).
- Crous, A. M., Abrahamse, H. Lung cancer stem cells and low-intensity laser irradiation: a potential future therapy. Stem Cell Research & Therapy. 4 (5), 129 (2013).
- Tomao, F., et al. Investigating molecular profiles of ovarian cancer: an update on cancer stem cells. Journal of Cancer. 5 (5), 301-310 (2014).
- Zhan, H. X., Xu, J. W., Wu, D., Zhang, T. P., Hu, S. Y. Pancreatic cancer stem cells: new insight into a stubborn disease. Cancer Letters. 357 (2), 429-437 (2015).
- Sharpe, B., Beresford, M., Bowen, R., Mitchard, J., Chalmers, A. D. Searching for prostate cancer stem cells: markers and methods. Stem Cell Reviews and Reports. 9 (5), 721-730 (2013).
- Lapidot, T., et al. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).
- Lee, C. -. H., Yu, C. -. C., Wang, B. -. Y., Chang, W. -. W. Tumorsphere as an effective in vitro platform for screening anti- cancer stem cell drugs. Oncotarget. 7 (2), 1215-1226 (2015).
- Sultan, I., Qaddoumi, I., Yaser, S., Rodriguez-Galindo, C., Ferrari, A. Comparing adult and pediatric rhabdomyosarcoma in the surveillance, epidemiology and end results program. Journal of Clinical Oncology. 27 (20), 3391-3397 (1973).
- Blum, J. M., et al. Distinct and overlapping sarcoma subtypes initiated from muscle stem and progenitor cells. Cell Reports. 5 (4), 933-940 (2013).
- Rubin, B. P., et al. Evidence for an unanticipated relationship between undifferentiated pleomorphic sarcoma and embryonal rhabdomyosarcoma. Cancer Cell. 19 (2), 177-191 (2011).
- Keller, C., et al. Alveolar rhabdomyosarcomas in conditional Pax3:Fkhr mice: cooperativity. of Ink4a/ARF and Trp53 loss of function. Genes & Development. 18 (21), 2614-2626 (2004).
- Tremblay, A. M., et al. The Hippo transducer YAP1 transforms activated satellite cells and is a potent effector of embryonal rhabdomyosarcoma formation. Cancer Cell. 26 (2), 273-287 (2014).
- Hatley, M. E., et al. A mouse model of rhabdomyosarcoma originating from the adipocyte lineage. Cancer Cell. 22 (4), 536-546 (2012).
- Drummond, C. J., et al. Hedgehog Pathway Drives Fusion-Negative Rhabdomyosarcoma Initiated From Non-myogenic Endothelial Progenitors. Cancer Cell. 33 (1), 108-124 (2018).
- Almazan-Moga, A., et al. Hedgehog Pathway Inhibition Hampers Sphere and Holoclone Formation in Rhabdomyosarcoma. Stem Cells International. , (2017).
- Walter, D., et al. CD133 positive embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population is enriched in rhabdospheres. PLoS One. 6 (5), (2011).
- Ciccarelli, C., et al. Key role of MEK/ERK pathway in sustaining tumorigenicity and in vitro radioresistance of embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population. Molecular Cancer. 15, (2016).
- Deel, M. D., et al. The Transcriptional Coactivator TAZ Is a Potent Mediator of Alveolar Rhabdomyosarcoma Tumorigenesis. Clinical Cancer Research. 24 (11), 2616-2630 (2018).
- Boscolo Sesillo, F., Fox, D., Sacco, A. Muscle Stem Cells Give Rise to Rhabdomyosarcomas in a Severe Mouse Model of Duchenne Muscular Dystrophy. Cell Reports. 26 (3), 689-701 (2019).
- Chamberlain, J. S., Metzger, J., Reyes, M., Townsend, D., Faulkner, J. A. Dystrophin-deficient mdx mice display a reduced life span and are susceptible to spontaneous rhabdomyosarcoma. The FASEB Journal. 21 (9), 2195-2204 (2007).
- Kessel, S., et al. High-Throughput 3D Tumor Spheroid Screening Method for Cancer Drug Discovery Using Celigo Image Cytometry. SLAS Technology. 22 (4), 454-465 (2017).
- Johnson, S., Chen, H., Lo, P. K. In vitro Tumorsphere Formation Assays. Bio-Protocol. 3 (3), (2013).
- Zhu, Z. W., et al. A novel three-dimensional tumorsphere culture system for the efficient and low-cost enrichment of cancer stem cells with natural polymers. Experimental and Therapeutic. 15 (1), 85-92 (2018).
- Takahashi, S. Downstream molecular pathways of FLT3 in the pathogenesis of acute myeloid leukemia: biology and therapeutic implications. Jornal of Hematology and Oncology. 4, (2011).
- Laouar, Y., Welte, T., Fu, X. Y., Flavell, R. A. STAT3 is required for Flt3L-dependent dendritic cell differentiation. Immunity. 19 (6), 903-912 (2003).
- Ogawa, M., Bergsagel, D. E., McCulloch, E. A. Differential effects of melphalan on mouse myeloma (adj. PC-5) and hemopoietic stem cells. Recherche en cancérologie. 31 (12), 2116-2119 (1971).
- Hamburger, A. W., Salmon, S. E. Primary bioassay of human tumor stem cells. Science. 197 (4302), 461-463 (1977).
- Hamburger, A. W. The human tumor clonogenic assay as a model system in cell biology. The International Journal of Cell Cloning. 5 (2), 89-107 (1987).
- Jimenez-Hernandez, L. E., et al. NRP1-positive lung cancer cells possess tumor-initiating properties. Oncology Reports. 39 (1), 349-357 (2018).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
- Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update. Molecular Carcinogenesis. 52 (3), 167-182 (2013).
- Salerno, M., et al. Sphere-forming cell subsets with cancer stem cell properties in human musculoskeletal sarcomas. International Journal of Oncology. 43 (1), 95-102 (2013).
