Tumorsphere härledning och behandling från primära tumörceller isolerade från mus Rhabdomyosarcomas
Summary
Detta protokoll beskriver en reproducerbar metod för isolering av mus rabdomyosarkom primära celler, tumorsphere formation och behandling, och transplantatavstötning transplantation från tumorspheres kulturer.
Abstract
Rhabdomyosarcoma (RMS) är den vanligaste mjukdelssarkom hos barn. Även om betydande insatser har möjliggjort identifiering av vanliga mutationer i samband med RMS och tillåten diskriminering av olika RMS-subtyper, finns det fortfarande stora utmaningar för utvecklingen av nya behandlingar för att ytterligare förbättra prognosen. Även identifieras genom uttrycket av myogena markörer, det finns fortfarande betydande kontrovers om huruvida RMS har Myogenic eller icke-Myogenic ursprung, som cellen ursprung är fortfarande dåligt förstått. I den aktuella studien finns en tillförlitlig metod för tumorsphere-analysen för mus RMS. Analysen är baserad på funktionella egenskaper tumörceller och gör det möjligt att identifiera sällsynta populationer i tumören med tumörframkallande funktioner. Beskrivs också är procedurer för att testa rekombinanta proteiner, integrera transfektion protokoll med tumorsphere assay, och utvärdera kandidat gener involverade i tumörutveckling och tillväxt. Beskrivs vidare är ett förfarande för transplantatavstötning transplantation av tumorspheres till mottagar möss att validera tumörframkallande funktion in vivo. Sammantaget ger den beskrivna metoden tillförlitlig identifiering och testning av sällsynta RMS-tumorigena populationer som kan tillämpas på RMS som uppstår i olika sammanhang. Slutligen kan protokollet utnyttjas som en plattform för läkemedels screening och framtida utveckling av Therapeutics.
Introduction
Cancer är en heterogen sjukdom; Dessutom, samma typ av tumör kan presentera olika genetiska mutationer hos olika patienter, och inom en patient en tumör består av flera populationer av celler1. Heterogenitet utgör en utmaning i identifieringen av celler som ansvarar för att initiera och sprida cancer, men deras karakterisering är avgörande för utvecklingen av effektiva behandlingar. Begreppet tumör föröknings celler (TPC), en sällsynt population av celler som bidrar till tumörutveckling, har tidigare utförligt granskats2. Trots det faktum att tpcs har karakteriserats i flera typer av cancer, är identifieringen av markörer för deras pålitliga isolering en utmaning för flera tumörtyper3,4,5,6 , 7 , 8 , 9. sålunda, en metod som inte förlitar sig på molekylära markörer utan snarare på TPC funktionella egenskaper (hög självförnyelse och förmågan att växa i låg-tillbehör villkor), känd som tumorsphere formation assay, kan tillämpas i stor utsträckning för identifiering av TPCs från de flesta tumörer. Viktigt, denna analys kan också användas för utbyggnad av tpcs och därmed direkt tillämpas på cancer Drug screening och studier om cancer resistens1,10.
Rhabdomyosarcoma (RMS) är en sällsynt form av mjukdelssarkom vanligast hos små barn11. Althoug RMS kan histologiskt identifieras genom bedömning av uttrycket av myogena markörer, har RMS-cellen av ursprung inte univokala kännetecknas på grund av de multipla tumör subtyper och hög heterogenitet av tumörutveckling stimuli. Nyligen genomförda studier har genererat en betydande vetenskaplig diskussion om huruvida RMS är av myogent eller icke-myogent ursprung, vilket tyder på att RMS kan härledas från olika celltyper beroende på sammanhanget12,13, fjorton , 15 , 16 , 17. ett flertal studier på RMS cellinjer har utförts med hjälp av tumorsphere formation analys för identifiering av vägar som är involverade i tumörutveckling och karakterisering av markörer i samband med mycket självförnyelse populationer 18 , 19 , 20 , 21.
Men trots tumorsphere formation assay potential för att identifiera RMS-celler ursprung, en tillförlitlig metod som kan användas på primära RMS-celler har ännu inte beskrivits. I detta sammanhang, en nyligen studie från vår grupp anställd en optimerad tumorsphere formation analys för identifiering av RMS-celler ursprung i en Duchennes muskeldystrofi (DMD) musmodell22. Flera pre-tumorigena celltyper, isolerade från muskelvävnad, testas för sin förmåga att växa i låg-tillbehör villkor, så att identifieringen av muskelstamceller som celler av ursprung för RMS i dystrofa sammanhang. Beskrivs här är ett reproducerbart och tillförlitligt protokoll för tumorsphere formation assay (figur 1), som har framgångsrikt använts för identifiering av extremt sällsynta cellpopulationer som är ansvariga för mus RMS utveckling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flera metoder har använts för isolering och karakterisering av tpcs från tumör heterogena cellpopulationer: tumör klonogena assays, FACS isolering och tumorsphere formation assay. Tumören klonogena analysen beskrevs första gången i 1971, används för stamcells studier, och först därefter tillämpas på cancerbiologi29,30. Denna metod är baserad på cancer stamcells inneboende egenskapen att expandera utan begränsningar i mjuka geler kulturer<sup clas…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Ellison Medical Foundation Grant AG-NS-0843-11, och NIH pilot Grant inom NCI Cancer Center support Grant P30CA030199 till A.S.
Materials
| Accutase cell dissociation reagent | Gibco | A1110501 | Detach adherent cells and dissociate tumorspheres |
| Celigo | Nexcelom | Celigo | Microwell plate based image cytometer for adherent and suspension cells |
| Collagenase, Type II | Life Technologies | 17101015 | Tissue digestion enzyme |
| Dispase II, protease | Life Technologies | 17105041 | Tissue digestion enzyme |
| DMEM high glucose media | Gibco | 11965092 | Component of tumor cells media |
| DMEM/F12 Media | Gibco | 11320033 | Component of tumosphere media |
| EDTA | ThermoFisher | S312500 | Component of FACS buffer |
| EGF recombinant mouse protein | Gibco | PMG8041 | Component of tumosphere media |
| FACSAria II Flow Cytometry | BD Biosciences | 650033 | Fluorescent activated cell sorter |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-11 | Component of tumor cells media |
| Fluriso (Isofluornae) anesthetic agent | MWI Vet Supply | 502017 | Anesthetic reagent for animals |
| FxCycle Violet Stain | Life Technologies | F10347 | Discriminate live and dead cells |
| Goat Serum | Life Technologies | 16210072 | Component of FACS buffer |
| Ham's F10 Media | Life Technologies | 11550043 | Component of FACS buffer |
| Horse Serum | Life Technologies | 16050114 | Component of cell isolation media |
| Lipofectamine 3000 transfection reagent | ThermoFisher | L3000015 | Transfection Reagent |
| Matrigel membrane matrix | Corning | CB40234 | Provides support to trasplanted cells |
| N-2 Supplemtns (100X) | Gibco | 17502048 | Component of tumosphere media |
| Neomycin-Polymyxin B Sulfates-Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment | MWI Vet Supply | 701008 | Eyes ointment |
| PBS | Gibco | 10010023 | Component of FACS buffer and used for washing cells |
| pEGFP-C1 | Addgene | 6084-1 | GFP plasmid |
| Penicillin – Streptomyocin | Life Technologies | 15140163 | Component of tumosphere and tumor cells media |
| Recombinant Human βFGF-basic | Peprotech | 10018B | Component of tumosphere media |
| Recombinant mouse Flt-3 Ligand Protein | R&D Systems | 427-FL-005 | Recombinant protein |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | Discriminate live and dead cells |
References
- Dagogo-Jack, I., Shaw, A. T. Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (2), 81-94 (2018).
- Wicha, M. S., Liu, S., Dontu, G. Cancer stem cells: an old idea–a paradigm shift. Recherche en cancérologie. 66 (4), 1883-1890 (2006).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Oishi, N., Yamashita, T., Kaneko, S. Molecular biology of liver cancer stem cells. Liver Cancer. 3 (2), 71-84 (2014).
- Crous, A. M., Abrahamse, H. Lung cancer stem cells and low-intensity laser irradiation: a potential future therapy. Stem Cell Research & Therapy. 4 (5), 129 (2013).
- Tomao, F., et al. Investigating molecular profiles of ovarian cancer: an update on cancer stem cells. Journal of Cancer. 5 (5), 301-310 (2014).
- Zhan, H. X., Xu, J. W., Wu, D., Zhang, T. P., Hu, S. Y. Pancreatic cancer stem cells: new insight into a stubborn disease. Cancer Letters. 357 (2), 429-437 (2015).
- Sharpe, B., Beresford, M., Bowen, R., Mitchard, J., Chalmers, A. D. Searching for prostate cancer stem cells: markers and methods. Stem Cell Reviews and Reports. 9 (5), 721-730 (2013).
- Lapidot, T., et al. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).
- Lee, C. -. H., Yu, C. -. C., Wang, B. -. Y., Chang, W. -. W. Tumorsphere as an effective in vitro platform for screening anti- cancer stem cell drugs. Oncotarget. 7 (2), 1215-1226 (2015).
- Sultan, I., Qaddoumi, I., Yaser, S., Rodriguez-Galindo, C., Ferrari, A. Comparing adult and pediatric rhabdomyosarcoma in the surveillance, epidemiology and end results program. Journal of Clinical Oncology. 27 (20), 3391-3397 (1973).
- Blum, J. M., et al. Distinct and overlapping sarcoma subtypes initiated from muscle stem and progenitor cells. Cell Reports. 5 (4), 933-940 (2013).
- Rubin, B. P., et al. Evidence for an unanticipated relationship between undifferentiated pleomorphic sarcoma and embryonal rhabdomyosarcoma. Cancer Cell. 19 (2), 177-191 (2011).
- Keller, C., et al. Alveolar rhabdomyosarcomas in conditional Pax3:Fkhr mice: cooperativity. of Ink4a/ARF and Trp53 loss of function. Genes & Development. 18 (21), 2614-2626 (2004).
- Tremblay, A. M., et al. The Hippo transducer YAP1 transforms activated satellite cells and is a potent effector of embryonal rhabdomyosarcoma formation. Cancer Cell. 26 (2), 273-287 (2014).
- Hatley, M. E., et al. A mouse model of rhabdomyosarcoma originating from the adipocyte lineage. Cancer Cell. 22 (4), 536-546 (2012).
- Drummond, C. J., et al. Hedgehog Pathway Drives Fusion-Negative Rhabdomyosarcoma Initiated From Non-myogenic Endothelial Progenitors. Cancer Cell. 33 (1), 108-124 (2018).
- Almazan-Moga, A., et al. Hedgehog Pathway Inhibition Hampers Sphere and Holoclone Formation in Rhabdomyosarcoma. Stem Cells International. , (2017).
- Walter, D., et al. CD133 positive embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population is enriched in rhabdospheres. PLoS One. 6 (5), (2011).
- Ciccarelli, C., et al. Key role of MEK/ERK pathway in sustaining tumorigenicity and in vitro radioresistance of embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population. Molecular Cancer. 15, (2016).
- Deel, M. D., et al. The Transcriptional Coactivator TAZ Is a Potent Mediator of Alveolar Rhabdomyosarcoma Tumorigenesis. Clinical Cancer Research. 24 (11), 2616-2630 (2018).
- Boscolo Sesillo, F., Fox, D., Sacco, A. Muscle Stem Cells Give Rise to Rhabdomyosarcomas in a Severe Mouse Model of Duchenne Muscular Dystrophy. Cell Reports. 26 (3), 689-701 (2019).
- Chamberlain, J. S., Metzger, J., Reyes, M., Townsend, D., Faulkner, J. A. Dystrophin-deficient mdx mice display a reduced life span and are susceptible to spontaneous rhabdomyosarcoma. The FASEB Journal. 21 (9), 2195-2204 (2007).
- Kessel, S., et al. High-Throughput 3D Tumor Spheroid Screening Method for Cancer Drug Discovery Using Celigo Image Cytometry. SLAS Technology. 22 (4), 454-465 (2017).
- Johnson, S., Chen, H., Lo, P. K. In vitro Tumorsphere Formation Assays. Bio-Protocol. 3 (3), (2013).
- Zhu, Z. W., et al. A novel three-dimensional tumorsphere culture system for the efficient and low-cost enrichment of cancer stem cells with natural polymers. Experimental and Therapeutic. 15 (1), 85-92 (2018).
- Takahashi, S. Downstream molecular pathways of FLT3 in the pathogenesis of acute myeloid leukemia: biology and therapeutic implications. Jornal of Hematology and Oncology. 4, (2011).
- Laouar, Y., Welte, T., Fu, X. Y., Flavell, R. A. STAT3 is required for Flt3L-dependent dendritic cell differentiation. Immunity. 19 (6), 903-912 (2003).
- Ogawa, M., Bergsagel, D. E., McCulloch, E. A. Differential effects of melphalan on mouse myeloma (adj. PC-5) and hemopoietic stem cells. Recherche en cancérologie. 31 (12), 2116-2119 (1971).
- Hamburger, A. W., Salmon, S. E. Primary bioassay of human tumor stem cells. Science. 197 (4302), 461-463 (1977).
- Hamburger, A. W. The human tumor clonogenic assay as a model system in cell biology. The International Journal of Cell Cloning. 5 (2), 89-107 (1987).
- Jimenez-Hernandez, L. E., et al. NRP1-positive lung cancer cells possess tumor-initiating properties. Oncology Reports. 39 (1), 349-357 (2018).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
- Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update. Molecular Carcinogenesis. 52 (3), 167-182 (2013).
- Salerno, M., et al. Sphere-forming cell subsets with cancer stem cell properties in human musculoskeletal sarcomas. International Journal of Oncology. 43 (1), 95-102 (2013).
