En komplet pipeline til isolering og sekvensering af MicroRNAs og analyse af dem ved hjælp af open source-værktøjer
Summary
Her beskriver vi en trinvis strategi for isolering af små RNAs, berigende for microRNAs og klargøring af prøver til sekvensering med høj gennemløb. Vi beskriver derefter, hvordan man behandler sekvens læsninger og justerer dem til microRNAs ved hjælp af open source-værktøjer.
Abstract
Halvdelen af alle menneskelige udskrifter menes at være reguleret af microRNAs. Derfor kan kvantificering af microRNA-ekspression afsløre underliggende mekanismer i sygdomstilstande og give terapeutiske mål og biomarkører. Her, vi detaljer, hvordan man præcist kvantificere microRNAs. Kort, denne metode beskriver isolerende microRNAs, ligating dem til adaptere egnet til high-gennemløb sekvensering, forstærke de endelige produkter, og forberede et eksempel bibliotek. Derefter forklarer vi, hvordan man justerer de opnåede sekvensering læser til microRNA Hårnåle, og kvantificere, normalisere, og beregne deres differens udtryk. Alsidig og robust, denne kombinerede eksperimentelle workflow og bioinformatik analyse giver brugerne mulighed for at begynde med vævs ekstraktion og finish med MicroRNA kvantificering.
Introduction
Først opdaget i 19931, det anslås nu, at næsten 2000 microRNAs er til stede i det menneskelige genom2. Micrornas er små ikke-kodning RNAs, der typisk er 21-24 nukleotider lang. De er post-transkriptionelle regulatorer af genekspression, ofte bindende til komplementære steder i den 3-ikke-oversat region (3-UTR) af Target gener til at undertrykke protein udtryk og forringe mRNA. Kvantificering af microRNAs kan give værdifuld indsigt i genekspression, og flere protokoller er blevet udviklet til dette formål3.
Vi har udviklet en defineret, reproducerbar og mangeårig protokol til små RNA-sekvensering og til analyse af normaliserede læsninger ved hjælp af open source bioinformatik værktøjer. Vigtigere er, at vores protokol muliggør samtidig identifikation af både endogene microRNAs og eksogent leverede konstruktioner, der producerer microRNA-lignende arter, mens minimere læser, der kort til andre små RNA arter, herunder ribosomale RNAs ( rRNAs), overførsel af RNA-afledte små RNAs (tsRNAs), gentagne afledte små RNAs-og mRNA-nedbrydningsprodukter. Heldigvis, microRNAs er 5-phosphorylated og 2-3 hydroxyleret4, en funktion, der kan udnyttes til at adskille dem fra disse andre små RNAs og mRNA nedbrydningsprodukter. Flere kommercielle muligheder findes for microRNA kloning og sekvensering, der er ofte hurtigere og lettere at multiplex; men den proprietære karakter af kit reagenser og deres hyppige modifikationer gør sammenligning prøvekørsler udfordrende. Vores strategi optimerer indsamlingen kun den korrekte størrelse af microRNAs gennem acrylamid og agrose gel rensning trin. I denne protokol beskriver vi også en procedure for justering af sekvens læsninger til microRNAs ved hjælp af open source-værktøjer. Dette sæt af instruktioner vil være særligt nyttigt for nybegyndere Informatik brugere, uanset om vores bibliotek forberedelse metode eller en kommerciel metode anvendes.
Denne protokol er blevet anvendt i flere offentliggjorte undersøgelser. For eksempel, det blev brugt til at identificere den mekanisme, hvormed Dicer enzym spalter små hårnål RNAs i en afstand af to nukleotider fra den interne løkke af stammen-loop struktur-den såkaldte “loop-Counting regel”5. Vi har også fulgt disse metoder til at identificere den relative overflod af leverede små hårnål RNAs (shRNA) udtrykt fra rekombinant adeno-associerede virale vektorer (rAAVs), at identificere tærsklen for shRNA udtryk, der kan tolereres før leveren toksicitet forbundet med overskydende shRNA-udtryk6. Ved hjælp af denne protokol, vi også identificeret microRNAs i leveren, der reagerer på fraværet af microRNA-122-en højt udtrykt hepatisk microRNA-samtidig kendetegner nedbrydningen mønster af denne microRNA7. Fordi vi har brugt vores protokol konsekvent i talrige eksperimenter, har vi været i stand til at observere prøve præparater i længderetningen, og se, at der ikke er nogen mærkbar batch effekter.
I deling af denne protokol, vores mål er at give brugerne mulighed for at generere høj kvalitet, reproducerbar kvantificering af microRNAs i stort set alle væv eller cellelinje, ved hjælp af overkommelige udstyr og reagenser, og gratis bioinformatik værktøjer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Trods identifikationen af microRNAs over 20 år siden13, processen med MicroRNA sekvensering forbliver omstændelig og kræver specialiseret udstyr, hindrer laboratorier fra rutinemæssigt at vedtage in-House protokoller14. Andre teknikker kan samtidig evaluere microRNAs, ligesom microRNA mikroarrays og multiplexed udtryks paneler; Men, disse tilgange er begrænset i, at de kun kvantificere microRNAs til stede i deres sonde sæt. På grund af dette, de savner vigtige funkti…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke medlemmerne af laboratorierne i Andrew fire og Mark Kay for vejledning og forslag.
Materials
| 100 bp DNA ladder | NEB | N3231 | |
| 19:1 bis-acrylamide | Millipore Sigma | A9926 | |
| 25 bp DNA step ladder | Promega | G4511 | |
| Acid phenol/chloroform | ThermoFisher | AM9720 | |
| Acrylamide RNA loading dye | ThermoFisher | R0641 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Biorad | 161-0700 | |
| Bioanalyzer instrument | Agilent | G2991AA | For assessing RNA quality and concentration |
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-500 | |
| Ethanol (100%) | Sigma | E7023 | |
| Gel Loading Buffer II | ThermoFisher | AM8547 | |
| GlycoBlue | ThermoFisher | AM9516 | Blue color helps in visualizing pellet |
| HCl | Sigma | 320331 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Maxi Vertical Gel Box 20 x 20cm | Genesee | 45-109 | |
| miRVana microRNA isolation kit | ThermoFisher | AM1560 | |
| miSeq system | Illumina | SY-410-1003 | For generating small RNA sequencing data |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Nusieve low-melting agarose | Lonza | 50081 | |
| Parafilm (laboratory sealing film) | Millipore Sigma | P7793 | |
| Poly-ethylene glycol 8000 | NEB | included with M0204 | |
| ProtoScript II First strand cDNA Synthesis Kit | NEB | E6560S | |
| QIAquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Qubit Fluorometer | ThermoFisher | Q33226 | For quantifying DNA concentration |
| Qubit RNA HS Assay kit | ThermoFisher | Q32855 | |
| Razor Blades | Fisher Scientific | 12640 | |
| Siliconized Low-Retention 1.5 ml tubes | Fisher Scientific | 02-681-331 | |
| T4 RNA ligase 1 | NEB | M0204 | |
| T4 RNA Ligase 2, truncated | NEB | M0242S | |
| TapeStation | Agilent | G2939BA | For assessing RNA quality and concentration |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273X | |
| TEMED | Biorad | 161-0800 | |
| Tris Base pH 7.5 | Sigma | 10708976001 | |
| Tris-buffered EDTA | Sigma | T9285 | |
| Trizol | ThermoFisher | 15596026 | |
| UltraPure Ethidium bromide (10 mg/ml) | Invitrogen | 15585-011 | |
| Universal miRNA cloning linker | NEB | S1315S | |
| Urea | Sigma | U5378 |
References
- Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
- Bartel, D. P. Metazoan MicroRNAs. Cell. 173 (1), 20-51 (2018).
- Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans. Science. 294 (5543), 858-862 (2001).
- Kim, V. N., Han, J., Siomi, M. C. Biogenesis of small RNAs in animals. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (2), 126-139 (2009).
- Gu, S., et al. The loop position of shRNAs and pre-miRNAs is critical for the accuracy of dicer processing in vivo. Cell. 151 (4), 900-911 (2012).
- Valdmanis, P. N., et al. RNA interference-induced hepatotoxicity results from loss of the first synthesized isoform of microRNA-122 in mice. Nature Medicine. 22 (5), 557-562 (2016).
- Valdmanis, P. N., et al. miR-122 removal in the liver activates imprinted microRNAs and enables more effective microRNA-mediated gene repression. Nature Communications. 9 (1), 5321 (2018).
- Griffiths-Jones, S. The microRNA Registry. Nucleic Acids Research. 32, D109-D111 (2004).
- Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34 (Database issue), D140-D144 (2006).
- Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36 (Database issue), D154-D158 (2008).
- Patro, R., Mount, S. M., Kingsford, C. Sailfish enables alignment-free isoform quantification from RNA-seq reads using lightweight algorithms. Nature Biotechnology. 32 (5), 462-464 (2014).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Etheridge, A., Wang, K., Baxter, D., Galas, D. Preparation of Small RNA NGS Libraries from Biofluids. Methods in Molecular Biology. 1740, 163-175 (2018).
- Yamane, D., et al. Differential hepatitis C virus RNA target site selection and host factor activities of naturally occurring miR-122 3 variants. Nucleic Acids Research. 45 (8), 4743-4755 (2017).
- Giraldez, M. D., et al. Comprehensive multi-center assessment of small RNA-seq methods for quantitative miRNA profiling. Nature Biotechnology. 36 (8), 746-757 (2018).
- Dard-Dascot, C., et al. Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing. BMC Genomics. 19 (1), 118 (2018).
- Yeri, A., et al. Evaluation of commercially available small RNASeq library preparation kits using low input RNA. BMC Genomics. 19 (1), 331 (2018).
- Coenen-Stass, A. M. L., et al. Evaluation of methodologies for microRNA biomarker detection by next generation sequencing. RNA Biology. 15 (8), 1133-1145 (2018).
- Baran-Gale, J., et al. Addressing Bias in Small RNA Library Preparation for Sequencing: A New Protocol Recovers MicroRNAs that Evade Capture by Current Methods. Frontiers in Genetics. 6, 352 (2015).
- Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39 (21), e141 (2011).
- Van Nieuwerburgh, F., et al. Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing. PLoS One. 6 (10), e26969 (2011).
- Valdmanis, P. N., et al. Upregulation of the microRNA cluster at the Dlk1-Dio3 locus in lung adenocarcinoma. Oncogene. 34 (1), 94-103 (2015).
- Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. Data Normalization Strategies for MicroRNA Quantification. Clinical Chemistry. 61 (11), 1333-1342 (2015).
- Viollet, S., Fuchs, R. T., Munafo, D. B., Zhuang, F., Robb, G. B. T4 RNA ligase 2 truncated active site mutants: improved tools for RNA analysis. BMC Biotechnology. 11, 72 (2011).
- Chiang, H. R., et al. Mammalian microRNAs: experimental evaluation of novel and previously annotated genes. Genes & Development. 24 (10), 992-1009 (2010).
- Fromm, B., et al. A Uniform System for the Annotation of Vertebrate microRNA Genes and the Evolution of the Human microRNAome. Annual Review of Genetics. 49, 213-242 (2015).
