Een complete pijplijn voor het isoleren en Sequentiëren van Microrna's en het analyseren ervan met open source tools
Summary
Hier beschrijven we een stapsgewijze strategie voor het isoleren van kleine Rna’s, verrijkend voor Microrna’s en het voorbereiden van samples voor sequentiëren met hoge doorvoer. Vervolgens beschrijven we hoe u de volgorde leest en lijnt u deze uit op microRNAs met behulp van open source tools.
Abstract
De helft van alle menselijke transcripties wordt verondersteld te worden gereguleerd door microRNAs. Daarom kan het kwantificeren van de microRNA-uitdrukking onderliggende mechanismen in ziektetoestanden onthullen en therapeutische doelen en biomarkers bieden. Hier wordt gedetailleerd beschreven hoe u Microrna’s nauwkeurig kwantificeren. In het kort beschrijft deze methode het isoleren van Microrna’s, het ligeren ervan aan adapters die geschikt zijn voor sequentiëren met hoge doorvoer, het versterken van de eindproducten en het voorbereiden van een voorbeeld bibliotheek. Vervolgens leggen we uit hoe de verkregen sequentiëren leesbewerkingen kunnen uitlijnen op microRNA haarspelden, en kwantificeren, normaliseren en berekenen van hun differentiële uitdrukking. Veelzijdig en robuust, deze gecombineerde experimentele workflow en bio informatica analyse stelt gebruikers in staat om te beginnen met weefsel extractie en finish met microRNA kwantificering.
Introduction
Voor het eerst ontdekt in 19931, is nu geschat dat bijna 2000 Microrna’s aanwezig zijn in het menselijk genoom2. Microrna’s zijn kleine niet-Codeer Rna’s die meestal 21-24 nucleotiden lang zijn. Het zijn posttranscriptionele regulatoren van genexpressie, vaak bindend voor complementaire locaties in de 3-onvertaalde regio (3-UTR) van doel genen om eiwit expressie te onderdrukken en mRNA te degraderen. Het kwantificeren van Microrna’s kan waardevol inzicht geven in genexpressie en er zijn verschillende protocollen voor dit doel ontwikkeld3.
We hebben een gedefinieerd, reproduceerbaar en lang staand protocol ontwikkeld voor kleine RNA-sequencing en voor het analyseren van genormaliseerde leesbewerkingen met open source bioinformatica tools. Belangrijk is dat ons protocol de gelijktijdige identificatie van zowel endogene Microrna’s als exogenously geleverde constructies die microRNA-achtige soorten produceren mogelijk maakt, terwijl leest die naar andere kleine RNA-soorten, waaronder ribosomale Rna’s ( rRNAs), overdracht van RNA-afgeleide kleine Rna’s (Tsrna’s), herhaald afgeleide kleine Rna’s, en mRNA afbraakproducten. Gelukkig zijn microrna’s 5-fosforyleerd en 2-3 gehydroxyleerde4, een functie die kan worden gebruikt om ze te scheiden van deze andere kleine rna’s en mRNA afbraakproducten. Er bestaan verschillende commerciële opties voor het klonen en sequentiëren van microRNA die vaak sneller en gemakkelijker te multiplex zijn; echter, de gepatenteerde aard van Kit reagentia en hun frequente modificaties maakt het vergelijken van monster runs uitdagend. Onze strategie optimaliseert het verzamelen van alleen de juiste grootte van Microrna’s door middel van acrylamide en agarose gel zuiveringsstappen. In dit protocol beschrijven we ook een procedure voor het uitlijnen van sequentie lezen op microRNAs met behulp van open source tools. Deze set instructies zal vooral nuttig zijn voor beginnende informatica gebruikers, ongeacht of onze bibliotheek bereidingsmethode of een commerciële methode wordt gebruikt.
Dit protocol is gebruikt in verschillende gepubliceerde studies. Het werd bijvoorbeeld gebruikt om het mechanisme te identificeren waarmee het dicer-enzym kleine haarspeld Rna’s op een afstand van twee nucleotiden uit de interne lus van de stuurlus structuur-de zogenoemde “lustellings regel”5. We volgden ook deze methoden om de relatieve overvloed van geleverde kleine haarspeld Rna’s (shRNA) te identificeren, uitgedrukt uit recombinant adeno-geassocieerde virale vectoren (rAAVs), om de drempel van shRNA-expressie te identificeren die voorafgaand aan de lever kan worden getolereerd toxiciteit die gepaard gaat met overmatige shRNA-expressie6. Met dit protocol identificeerden we ook Microrna’s in de lever die reageren op de afwezigheid van microRNA-122-een sterk uitgedrukt hepatisch microRNA-terwijl het afbraak patroon van deze microRNA7ook kenmerkend is. Omdat we ons protocol consequent in tal van experimenten hebben gebruikt, hebben we de voorbereidingen in de lengterichting in de lengterichting kunnen observeren en zien dat er geen waarneembare batch-effecten zijn.
Bij het delen van dit protocol is het ons doel om gebruikers in staat te stellen hoge kwaliteit, reproduceerbare kwantificering van Microrna’s te genereren in vrijwel elke weefsel-of cellijn, met behulp van betaalbaar materiaal en reagentia, en gratis bioinformatica tools.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ondanks de identificatie van microRNAs meer dan 20 jaar geleden13, blijft het proces van microRNA-sequencing bewerkelijk en vereist gespecialiseerde apparatuur, waardoor laboratoria worden gehinderd om routinematig in-House protocollen14te hanteren. Andere technieken kunnen gelijktijdig Microrna’s evalueren, zoals microRNA micro arrays en Multiplexed expressie panelen; deze benaderingen zijn echter beperkt omdat ze alleen de microRNAs in hun testset kwantificeren. Hierdoor …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen de leden van de laboratoria van Andrew Fire en Mark Kay bedanken voor hun begeleiding en suggesties.
Materials
| 100 bp DNA ladder | NEB | N3231 | |
| 19:1 bis-acrylamide | Millipore Sigma | A9926 | |
| 25 bp DNA step ladder | Promega | G4511 | |
| Acid phenol/chloroform | ThermoFisher | AM9720 | |
| Acrylamide RNA loading dye | ThermoFisher | R0641 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Biorad | 161-0700 | |
| Bioanalyzer instrument | Agilent | G2991AA | For assessing RNA quality and concentration |
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-500 | |
| Ethanol (100%) | Sigma | E7023 | |
| Gel Loading Buffer II | ThermoFisher | AM8547 | |
| GlycoBlue | ThermoFisher | AM9516 | Blue color helps in visualizing pellet |
| HCl | Sigma | 320331 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Maxi Vertical Gel Box 20 x 20cm | Genesee | 45-109 | |
| miRVana microRNA isolation kit | ThermoFisher | AM1560 | |
| miSeq system | Illumina | SY-410-1003 | For generating small RNA sequencing data |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Nusieve low-melting agarose | Lonza | 50081 | |
| Parafilm (laboratory sealing film) | Millipore Sigma | P7793 | |
| Poly-ethylene glycol 8000 | NEB | included with M0204 | |
| ProtoScript II First strand cDNA Synthesis Kit | NEB | E6560S | |
| QIAquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Qubit Fluorometer | ThermoFisher | Q33226 | For quantifying DNA concentration |
| Qubit RNA HS Assay kit | ThermoFisher | Q32855 | |
| Razor Blades | Fisher Scientific | 12640 | |
| Siliconized Low-Retention 1.5 ml tubes | Fisher Scientific | 02-681-331 | |
| T4 RNA ligase 1 | NEB | M0204 | |
| T4 RNA Ligase 2, truncated | NEB | M0242S | |
| TapeStation | Agilent | G2939BA | For assessing RNA quality and concentration |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273X | |
| TEMED | Biorad | 161-0800 | |
| Tris Base pH 7.5 | Sigma | 10708976001 | |
| Tris-buffered EDTA | Sigma | T9285 | |
| Trizol | ThermoFisher | 15596026 | |
| UltraPure Ethidium bromide (10 mg/ml) | Invitrogen | 15585-011 | |
| Universal miRNA cloning linker | NEB | S1315S | |
| Urea | Sigma | U5378 |
References
- Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
- Bartel, D. P. Metazoan MicroRNAs. Cell. 173 (1), 20-51 (2018).
- Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans. Science. 294 (5543), 858-862 (2001).
- Kim, V. N., Han, J., Siomi, M. C. Biogenesis of small RNAs in animals. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (2), 126-139 (2009).
- Gu, S., et al. The loop position of shRNAs and pre-miRNAs is critical for the accuracy of dicer processing in vivo. Cell. 151 (4), 900-911 (2012).
- Valdmanis, P. N., et al. RNA interference-induced hepatotoxicity results from loss of the first synthesized isoform of microRNA-122 in mice. Nature Medicine. 22 (5), 557-562 (2016).
- Valdmanis, P. N., et al. miR-122 removal in the liver activates imprinted microRNAs and enables more effective microRNA-mediated gene repression. Nature Communications. 9 (1), 5321 (2018).
- Griffiths-Jones, S. The microRNA Registry. Nucleic Acids Research. 32, D109-D111 (2004).
- Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34 (Database issue), D140-D144 (2006).
- Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36 (Database issue), D154-D158 (2008).
- Patro, R., Mount, S. M., Kingsford, C. Sailfish enables alignment-free isoform quantification from RNA-seq reads using lightweight algorithms. Nature Biotechnology. 32 (5), 462-464 (2014).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Etheridge, A., Wang, K., Baxter, D., Galas, D. Preparation of Small RNA NGS Libraries from Biofluids. Methods in Molecular Biology. 1740, 163-175 (2018).
- Yamane, D., et al. Differential hepatitis C virus RNA target site selection and host factor activities of naturally occurring miR-122 3 variants. Nucleic Acids Research. 45 (8), 4743-4755 (2017).
- Giraldez, M. D., et al. Comprehensive multi-center assessment of small RNA-seq methods for quantitative miRNA profiling. Nature Biotechnology. 36 (8), 746-757 (2018).
- Dard-Dascot, C., et al. Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing. BMC Genomics. 19 (1), 118 (2018).
- Yeri, A., et al. Evaluation of commercially available small RNASeq library preparation kits using low input RNA. BMC Genomics. 19 (1), 331 (2018).
- Coenen-Stass, A. M. L., et al. Evaluation of methodologies for microRNA biomarker detection by next generation sequencing. RNA Biology. 15 (8), 1133-1145 (2018).
- Baran-Gale, J., et al. Addressing Bias in Small RNA Library Preparation for Sequencing: A New Protocol Recovers MicroRNAs that Evade Capture by Current Methods. Frontiers in Genetics. 6, 352 (2015).
- Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39 (21), e141 (2011).
- Van Nieuwerburgh, F., et al. Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing. PLoS One. 6 (10), e26969 (2011).
- Valdmanis, P. N., et al. Upregulation of the microRNA cluster at the Dlk1-Dio3 locus in lung adenocarcinoma. Oncogene. 34 (1), 94-103 (2015).
- Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. Data Normalization Strategies for MicroRNA Quantification. Clinical Chemistry. 61 (11), 1333-1342 (2015).
- Viollet, S., Fuchs, R. T., Munafo, D. B., Zhuang, F., Robb, G. B. T4 RNA ligase 2 truncated active site mutants: improved tools for RNA analysis. BMC Biotechnology. 11, 72 (2011).
- Chiang, H. R., et al. Mammalian microRNAs: experimental evaluation of novel and previously annotated genes. Genes & Development. 24 (10), 992-1009 (2010).
- Fromm, B., et al. A Uniform System for the Annotation of Vertebrate microRNA Genes and the Evolution of the Human microRNAome. Annual Review of Genetics. 49, 213-242 (2015).
