इस लेख में मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल व्युत्पन्न cardiomycyte (HIPSC-CM) नेटवर्क के विकास के लिए प्रोटोकॉल का एक सेट शामिल है बहुवेल MEA प्लेटों पर सुसंस्कृत कार्रवाई संभावित माप के लिए सेल झिल्ली reversibly electroporate करने के लिए. उच्च-थ्रूपुट रिकॉर्डिंग्स एक ही सेल साइटों से दिनों-बार प्राप्त की जाती हैं।
कार्डिएक सुरक्षा स्क्रीनिंग दवा की खोज और चिकित्सकीय के लिए सर्वोपरि महत्व का है। इसलिए, HIPSC व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट (HIPSC-सीएम) की तैयारी के लिए उपन्यास उच्च-थ्रूपुट इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल दृष्टिकोण का विकास कुशल दवा परीक्षण के लिए बहुत आवश्यक है। हालांकि multielectrode सरणियां (MEAs) अक्सर उत्तेजक कोशिकाओं के क्षेत्र संभावित माप के लिए कार्यरत हैं, जोशी-मुखर्जी और उनके सहयोगियों द्वारा हाल ही में एक प्रकाशन वर्णित है और आवर्तक कार्रवाई क्षमता (एपी) रिकॉर्डिंग के लिए अपने आवेदन मान्य एक ही hiPSC-सीएम की तैयारी से दिन में. यहाँ उद्देश्य के लिए मुख्य चिकित्सा बीज बोने के लिए विस्तृत कदम दर कदम तरीकों प्रदान करने के लिए और उच्च परिशुद्धता और 1 डिग्री के एक अस्थायी संकल्प के साथ इलेक्ट्रोपोट्रेशन के माध्यम से एपी waveforms को मापने के लिए है. यह दृष्टिकोण विश्वसनीय इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल जांच के लिए उच्च-थ्रूपुट एपी माप के लिए इंट्रासेल्यूलर पहुँच प्राप्त करने के लिए उपयोग में आसान पद्धति की कमी को संबोधित करता है। मल्टीवेल एमईए प्लेटों पर HIPSC-सीएम के चढ़ाना के लिए एक विस्तृत कार्य प्रवाह और तरीकों पर चर्चा की जाती है जहां भी प्रासंगिक महत्वपूर्ण कदमों पर बल दिया जाता है। इसके अलावा, तेजी से डेटा हैंडलिंग, निष्कर्षण और विश्लेषण के लिए एक कस्टम निर्मित MATLAB स्क्रिप्ट में फंसा विभिन्न एपी अवधि मानकों के लिए आकृति विज्ञान में सूक्ष्म अंतर की मात्रा निर्धारित करने के लिए तरंग विश्लेषण की व्यापक जांच के लिए रिपोर्ट की है अतालता और कार्डियोटॉक्सिसिटी।
मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (HIPSC-सीएम) प्रयोगशालाओं की बढ़ती संख्या के लिए सोने के मानक हैं1,2,3,4,5,6 ,7,8,9,10. भ्रूणीय शरीर11,12,13 और एकपरत3,7,10,11,12, 13,14,15,16,17 विभेदन कार्डियोमायोसाइट उत्पादन के लिए पसंदीदा तरीके हैं और बहुइलेक्ट्रोड सरणी (एमईए) एक आम मोडलिटी बन गई है इन नेटवर्कों की विद्युत गतिकी की निगरानी के लिए18,19,20. जबकि पैरामीटर है कि क्षेत्र क्षमता से निकाला जा सकता है (FPs) इस तरह की धड़कन दर के रूप में, आयाम, अवधि और आरआर अंतराल स्वतः पिटाई monolayers18,21की आधारभूत electrophysiological प्रतिक्रियाओं रहे हैं 22,23, इन extracellular FP संकेतों के अंतर्निहित कार्रवाई क्षमता (एपी) घटकों24extrapolate करने के लिए मुश्किल है . प्रत्यक्ष आवर्तक एपी माप के लिए MEAs के एक आवेदन की खोज पर हमारे हाल ही में प्रकाशन कई भर में विभिन्न repolarization चरणों में एक व्यापक तरंग विश्लेषण के साथ अनुकरणीय intracellular एपी readouts के लिए पद्धति का सबूत प्रदान करता है HIPSC व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट नेटवर्क3के बैचों | अध्ययन में हमने दिखा दिया कि HIPSC व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स के नेटवर्क के लिए इलेक्ट्रोपोरेटिंग दालों की डिलीवरी एपी रिकॉर्डिंग के लिए इंट्रासेल्यूलर एक्सेस सक्षम बनाता है। येक्षणिक एपी रिकॉर्डिंग चोट स्थल3,25,26के माध्यम से देखी गई ट्रांसमेम्ब्रेन क्षमता वसूलियों पर निर्भर हैं . हमारे अध्ययन में विदेश भेजने और पैच-क्लैम्प के माध्यम से दर्ज वेवफॉर्म्स ने इसी प्रकार के एपी मॉर्फोलोजी को दिखाया जिससे दृष्टिकोण3की विश्वसनीयता मान्य होती है।
कुछ प्रयोगशालाओं ने कस्टम निर्मित एमईएएस18,21,26,27,28,29का उपयोग करके विभिन्न विद्युतजनित कोशिकाओं से ए पी को मापने की सूचना दी है, 30, लेकिन लगातार और आवर्तक एपी माप के लिए MEAs का उपयोग करने की विश्वसनीयता का मूल्यांकन नहीं किया गया था. वर्तमान में, सोने के मानक पैच-क्लैम्प तकनीक टर्मिनल रिकॉर्डिंग करने के लिए सीमित है7,31 जबकि, एमईए आधारित एपी माप क्षणिक हैं और इसलिए एक ही सेल पर कई बार आयोजित किया जा सकता है. हम यह भी बताते हैं कि एक आसानी से कम से कम फ़िल्टरिंग की आवश्यकता होती है millivolt रेंज में उच्च गुणवत्ता वाले एपी संकेतों को रिकॉर्ड कर सकते हैं. इसलिए शोधकर्ता एमईएएस का उपयोग करते हुए एक ही तैयारी में न केवल तीव्र बल्कि पुरानी दवा अध्ययन भी कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, यह तकनीक कम समय में एक साथ एफपी/एपी माप उत्पन्न करने की अनुमति देती है। अतालता भविष्यवाणी और दवा संबद्ध कार्डियोटॉक्सिसिटी पर बढ़ते जोर को देखते हुए24,32,33,34,35, एपी माप के एकीकरण दृष्टिकोण दवा सुरक्षा और प्रभावकारिता आकलन में वृद्धि होगी.
यहाँ, हम 1) परिपक्वता के लिए cryopreserved HIPSC-सीएम के पूर्व चढ़ाना, 2) multiwell MEAs पर HIPSC-सीएम के विघटन और चढ़ाना, 3) HIPSC-CM नेटवर्क से FPs और APs की रिकॉर्डिंग, 4) विभाजन और विश्लेषण के लिए डेटा निकालने, और 5) एकाधिक पुन: उपयोग के लिए सरणियों को पुनर्स्थापित करना. हर कदम जहाँ भी प्रासंगिक महत्वपूर्ण कदम पर बल देने अनुकूलित किया गया है. सेल लगाव के लिए आवश्यकताओं को सुनिश्चित करने के लिए एक पिटाई syncytial monolayer चर्चा कर रहे हैं और दोहराव electrophysiological अध्ययन के लिए multiwell MEA बहाली के लिए प्रक्रियाओं की व्याख्या कर रहे हैं. अंत में, प्रयोगशाला में विकसित एक कस्टम जीयूआई एपी संकेत निष्कर्षण, गुणवत्ता आश्वासन, और विभाजन कार्यप्रवाह के लिए प्रस्तुत किया है परिमाण और एपी मापदंडों का विश्लेषण करने के लिए.
इन वर्षों में एमईए का प्रयोग उनके इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों का अध्ययन करनेके लिए उत्तेजक कोशिकाओं के एफपी मापन को करने तक सीमित रहा है 36,37,38,39. केवल कुछ समूहों ने कस्टम एमईए आधारित प्रौद्योगिकी18,29,30का उपयोग करके इलेक्ट्रोजेनिक कोशिकाओं से एपी निशानों की सूचना दी है . तथापि, इन्हीं तैयारियों से बार-बार रिकॉर्डिंग करने के लिए इन तरीकों की जांच नहीं की गई है। हम एक साथ कई HIPSC-CM नेटवर्क में दिन में एक ही सेल साइट से एपीएस का अध्ययन करने के लिए एक अभिनव और सटीक पद्धति विकसितकी 3. हमारे प्रकाशित अध्ययन में, एक multiwell सूक्ष्म सोने विदेश गया मंच उच्च परिशुद्धता के साथ hiPSC-सीएम संस्कृतियों के कई बैचों से एपी तरंग पुस्तकालयों उत्पन्न करने के लिए नियोजित किया गया था और 1 के एक अस्थायी संकल्प के साथ. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल उच्च throughput एपी रिकॉर्डिंग के लिए syncytial मुख्यमंत्री नेटवर्क के कुशल विकास के लिए सरणी पर hiPSC-सीएम के बीज की व्याख्या करता है. प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम हैं: 1) क्रायोप्रेक्षण बैंकिंग के लिए गुणवत्ता नियंत्रित मुख्यमंत्री के कई उच्च शुद्धता बैचों का उत्पादन, 2) पूर्व चढ़ाना और परिपक्वता के लिए अत्यधिक व्यवहार्य पोस्ट-थॉव सीएम, 3) मुख्यमंत्री के लिए multiwell MEA प्लेट के उपचार सीडिंग, 4) HIPSC-सीएम संस्कृति विभाजन 30 दिनों के बाद MEA चढ़ाना के लिए भेदभाव, और 5) कई पुन: उपयोग के लिए MEAs की बहाली.
यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि HIPSC भेदभाव में बैच-टू-बैच भिन्नता प्रयोगात्मक परिणामों को प्रभावित कर सकती है। विभेद की मोनोलेयर विधि को उच्च प्रतिशत कार्डियोमायोसाइट उत्पादन3,40के लिए घर में अनुकूलित किया गया था . हमारी संस्कृतियों के MLC2v और TNNT2 मार्करों के FACS विश्लेषण एक $90% वेंट्रिकुलर की तरह phenotype3प्रदर्शित करता है. इन गुणवत्ता नियंत्रित संस्कृतियों प्रयोगात्मक अध्ययन के लिए cryopreserved हैं. वर्तमान विभेदन दृष्टिकोण नोडल के एक विषम मिश्रण उपज- एट्रियल – और निलय की तरह कोशिकाओं3,16,17,41. इसलिए, मुख्यमंत्री उपप्रकार जनसंख्या संवर्धन के लिए नियोजित रणनीतियों आगे संस्कृतियों की विशिष्टता में सुधार कर सकते हैं. इसके अतिरिक्त, ऊतक इंजीनियरिंग दृष्टिकोण उनकी परिपक्वता बढ़ाने के लिए नियोजित किया जा सकता है. यहां प्रस्तावित तरीकों को अन्य मुख्यमंत्री स्रोतों के लिए आसानी से लागू किया जा सकता है।
एमई का उपयोग कर दर्ज की गई एपी waveforms ऑप्टिकल मानचित्रण42,43, पूरक धातु ऑक्साइड अर्धचालक आधारित एमई 18,21, और नकली एपी द्वारा कार्डियोमायोसाइट्स के नेटवर्क से दर्ज उन लोगों के समान थे FP रिकॉर्डिंग20का उपयोग कर | MEA Hai और Spira25 के माध्यम से एपी माप के तंत्र को संबोधित करने के लिए प्रदर्शन किया है कि इलेक्ट्रोपोर-इलेक्ट्रोड इंटरफ़ेस स्थापित तेज ग्लास microelectrode तकनीक की नकल. हालांकि, हमारे अध्ययन में आराम झिल्ली क्षमता और सही आयाम मूल्यों को यह देखते हुए स्थापित नहीं किया जा सकता है कि विदेश में विद्युतमंडल-इलेक्ट्रोड इंटरफ़ेस calibrated नहीं है, और आयाम संवेदनशीलता और संकल्प का एक समारोह है तकनीक. हमारे दृष्टिकोण ऑप्टिकल मानचित्रण के लिए इसी तरह की सीमाओं के शेयरों जब यह एपी आयाम की बात आती है.
मल्टीवेल एमईए-आधारित एफपी/एपी readouts यहाँ दवा सुरक्षा आकलन के लिए नई संभावनाएं खुली सूचना दी. हालांकि सहज, इन HIPSC-CM monolayers लगातार दरों पर हराया. एकाधिक नेटवर्कों में APD पैरामीटरों का विश्लेषण विद्युत विषमता पर अंतर्दृष्टि प्रदान करता है (चित्र 13)। तथापि, व्यापक एपीडी पुनरास्थापन विश्लेषणों में पूर्ववर्ती डायस्टोलिक अंतरालों को शामिल किया जाना चाहिए। इसके अलावा, 96 एच से अधिक एक ही सेल साइट से दर्ज उच्च गुणवत्ता वाले एपी तरंग रूपों (चित्र 11ख) समय के साथ झिल्ली इलेक्ट्रोडायनामिक्स को ट्रैक करने के लिए पहली रिपोर्ट है जो विकास और रोग में मूल्य की होगी।
एपी पैरामीटर की मात्रा निर्धारित करने के लिए यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल यौगिकों का परीक्षण करने के लिए खुराक प्रतिक्रिया घटता उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. के रूप में हालही में एडवर्ड्स एट अल 3 द्वारा रिपोर्ट, norepinephrine की खुराक प्रतिक्रिया, आइसोप्रोटेरेनॉल और ई 4031 विभिन्न पुनर्करण चरणों में APD के लिए साजिश रची हैं. प्रकाशित अध्ययन सटीकता और वास्तविक समय में एपी waveforms में खुराक पर निर्भर सूक्ष्म परिवर्तन की पहचान के लिए दृष्टिकोण की विश्वसनीयता का प्रदर्शन किया. इस तकनीक को आसानी से विभिन्न electrophysiological प्रतिक्रियाओं को समझने के लिए अन्य यौगिकों या छोटे अणु पुस्तकालयों के लिए बढ़ाया जा सकता है.
इस अध्ययन में प्रस्तुत एपी माप के लिए विदेश राज्य अमेरिका आधारित दृष्टिकोण न केवल इलेक्ट्रोफिजियोलोजिस्ट के लिए बल्कि सेल जीवविज्ञानियों और इन-सिलिको मॉडलर्स के लिए भी ब्याज की होगी। इसके अलावा, HIPSC-सीएम पर एक ही सेल साइट से FP/AP रिकॉर्डिंग शोधकर्ताओं को समय की एक छोटी अवधि के भीतर उत्तेजक सेलुलर नेटवर्क की विस्तृत सरणी की bioelectric डेटा पुस्तकालयों उत्पन्न करने के लिए सक्षम हो जाएगा. इन संसाधनों की उपलब्धता दवा खोजों और रोग मॉडलिंग के लिए मूल्यवान होगी।
The authors have nothing to disclose.
कोई नहीं
Accutase | Sigma Aldrich | A6964-100ML | cell dissociation solution |
Acquisition software | Multichannel Systems | Multiwell-Screen v 1.9.2.0 | |
B27 Supplement | ThermoFisher | 17504-044 | CM media supplement |
Converter software | Multichannel Systems | MultiChannel DataManager | |
DMEM/F12 | ThermoFisher | 11330-032 | |
D-PBS | ThermoFisher | 14190-250 | |
FBS | Fisher Scientific | SH3007103HI | |
Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141-5MG | |
Geltrex | ThermoFisher | A1413202 | coating substrate |
Interface board | Multichannel Systems | MCS-IFB 3.0 Multiboot Interface Board | |
Multiwell MEA Plate | Multichannel Systems | 24W300/30G-288 | |
RPMI 1640 | ThermoFisher | 11875-093 | CM base medium |
Terg-a-zyme | Sigma Aldrich | Z273287-1EA | enzymatic detergent |
Transfer pipettes, individually wrapped | Fisher Scientific | 1371148 | |
Trypan Blue | Sigma Aldrich | T8154-100ML | |
Ultrapure sterile water | ThermoFisher | 10977-023 | |
6-well tissue-culture treated plates | Fisher Scientific | 08-772-1B |