In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction (en)

Résumé

Cet article représente un analyse in vitro utile pour évaluer la capacité du milieu conditionné des cellules de tumeur pour attirer des macrophages.

Résumé

Les macrophages associés aux tumeurs (TAM) représentent un grand pourcentage de cellules dans la masse tumorale pour différents types de cancers. Glioblastoma (GBM), une tumeur maligne de cerveau sans traitement, a jusqu'à la moitié de la masse tumorale TAMs. Les TAM peuvent être pro-tumoral ou anti-tumoral, selon l'activation de gènes spécifiques dans les cellules. Les mutations génétiques dans les tumeurs, par la régulation de l'expression cytokine, peuvent affecter le recrutement de TAMs au microenvironnement de tumeur. Ici, nous décrivons un essai cellulaire quantitatif pour évaluer le recrutement de macrophage par le milieu conditionné des cellules de tumeur. Cet exemple utilise la lignée cellulaire de macrophage humain MV-4-11 pour étudier l'attraction du macrophage par le milieu conditionné du glioblastome, ce qui permet une reproductibilité élevée et une faible variabilité. Les données générées avec cet analyse peuvent contribuer à une meilleure compréhension de l'interaction entre la tumeur et le microenvironnement tumoral. Des résultats similaires peuvent être utilisés pour évaluer l'interaction entre les cellules tumorales et d'autres cellules immunitaires, y compris les lymphocytes T et les cellules tueuses naturelles (NK).

Introduction

Les macrophages sont des cellules immunitaires à haute hétérogénéité phénotypique et fonctionnelle¹. Ils jouent des rôles importants dans les systèmes de défense hôte, la réparation des tissus, le développement et la progression tumorale¹. Les TAM sont des macrophages dans le microenvironnement des tumeurs solides. Certains TAMs peuvent favoriser la croissance de tumeur en inhibant l'activité cytotoxique T cellule-négociée, modulant le microenvironnement de tumeur (TME), favorisant l'angiogenèse, l'invasion et la métastasie^2,3,4....

Protocole

1. Préparation moyenne

1. Préparation du milieu des cellules souches sans sérum
   1. Décongelez le supplément de 50x B27, le facteur de croissance épidermique (EGF, 20 g/mL en acide acétique de 10 mM avec 0,1 % de BSA) et le facteur de croissance du fibroblaste (FGF, 20 g/mL dans 10 mM d'acide acétique avec 0,1 % de BSA).
   2. Ajouter 500 oL d'EGF (concentration finale 20 ng/mL), 500 oL de FGF (concentration finale 20 ng/mL), 10 ml de 50x B27 à 500 mL de Mélange d'aigle modifié/nutritif F-12 (DMEM/F12) et 5 mL de 100x Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) Inverser la bouteille 4-6 fois pour mélanger, filtrer la stérilisation à travers....

Résultats

Les résultats sont généralement affichés au moyen de graphiques à barres (exemple illustré à la figure 1). Des échantillons avec des valeurs élevées de 480/520 indiquent que le support conditionné a une grande capacité de recruter des macrophages. Selon les besoins expérimentaux, des contrôles supplémentaires peuvent être inclus. Par exemple, on peut utiliser des anticorps neutralisants pour traiter les médias conditionnés pour abolir la chimiotaxie macrophag.......

Discussion

Dans ce protocole, il y a plusieurs étapes clés : 1) sélection de l'insert Transwell. Pour la lignée cellulaire MV-4-11, les inserts Transwell de 5 m fonctionnent bien. Cependant, pour d'autres lignées cellulaires telles que la lignée cellulaire de monocytes THP-1 couramment utilisée, une taille de pores différente pourrait mieux fonctionner. 2) Comme différentes lignées cellulaires se développent à des vitesses différentes, il est important d'ajuster le volume des supports conditionnés en fonction du nombre de cellules........

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,1 &mu ; m tasse de filtration	Thermo fisher	566-0010
0.45 &mu ; Unité de filtration	m Millipore	SLHA033SS
Pipettes sérologiques de 10 mL	Olympus plastics	12-104
Tubes à centrifuger stériles de 15 mL	Olympus plastics	28-103
Pointe de pipette de 1 mL	Bioproduits moléculaires ART	2779-RI
Pipette d’aspiration de 2 mL	Falcon	357558
plaque à 24 puits	Millipore	ECM507	Partie de l’ECM507, ou peut être acheté séparément
4x tampon de lyse	Millipore	ECM507	Partie de l’ECM507, ou peut être acheté séparément
5 &mu ; m Insert Transwell	Millipore	ECM507	Fait partie de l’ECM507, ou peut être acheté séparément
75 cm2	Corning	430641U
Accutase Innovative	cell technologies	AT-104
B27	Gibco	12587-010
CyQuant Dye	Millipore	ECM507	Fait partie de l’ECM507, ou peut être acheté séparément
DMEM	Gibco	11965-092
DMEM :F12	Gibco	10565-018
EGF	Peprotech	AF-100-15
FBS	Gibco	26140
FGF	Peprotech	100-18B
IMDM	Gibco	12440-053
PBS	Gibco	14190-144
Stylo Strep	Gibco	15140-122
Trypan bleu	Biorad	1450021

flacon