A Murine Cell Line Based Model of Chronic CDK9 Inhibition to Study Widespread Non-Genetic Transcriptional Elongation Defects (TE definitely ) in Cancers A Murine Cell Line Based Model of Chronic CDK9 Inhibition to Study Widespread Non-Genetic Transcriptional Elongation Defects (TEdefinitely) in Cancers

Résumé

Le protocole détaille un modèle in vitro de carcinome murine de l'allongement défectueux non génétique de transcription. Ici, l'inhibition chronique de CDK9 est employée pour réprimer l'allongement productif de l'ARN Pol II le long des gènes pro-inflammatoires de réponse pour imiter et étudier le phénomène cliniquement surdes te^{certainement,} présent dans environ 20% de tous les types de cancer.

Résumé

Nous avons précédemment rapporté qu'un sous-ensemble de cancers est défini par des déréglementations transcriptionnelles globales avec des insuffisances répandues dans l'allongement de transcription d'ARNm (TE)-nous appelons tels cancers comme TE^{certainement.} Notamment, les cancers de TE sont^certainement caractérisés par la transcription fausse et le traitement défectueux d'ARNm dans un grand ensemble de gènes, tels que l'interféron/JAK/STAT et les voies de TNF/NF-B, menant à leur suppression. Le^sous-type te des tumeurs dans le carcinome rénal de cellules et les patients métastatiques de mélanome sensiblement corrélés avec la réponse et les résultats pauvres dans l'immunothérapie. Compte tenu de l'importance d'étudier les cancers DE l'TE, car il laisse présager un obstacle important contre l'immunothérapie, l'objectif de ce protocole est d'établir un modèle in vitro TE^{définitivement} souris pour étudier ces répandues, non-génétique anomalies transcriptionnelles dans les cancers et d'acquérir de nouvelles idées, de nouvelles utilisations pour les médicaments existants, ou de trouver de nouvelles stratégies contre ces cancers. Nous détaillons l'utilisation de l'inhibition chronique de CDK9 de flavopiridol négociée pour abroger la phosphorylation des résidus de sérine 2 sur le domaine de répétition C-terminal (CTD) de la polymérase II d'ARN (RNA Pol II), supprimant la libération de l'ARN Pol II dans la transcription productive Allongement. Étant donné que les cancers TE ne sont^certainement pas classés sous une mutation somatique spécifique, un modèle pharmacologique est avantageux, et imite le mieux les défauts transcriptionnels et épigénétiques répandus observés en eux. L'utilisation d'une dose sublétale optimisée de flavopiridol est la seule stratégie efficace dans la création d'un modèle généralisable de perturbation non génétique généralisée dans l'allongement de la transcription et les défauts de traitement de l'ARNm, imitant étroitement l'ETe observé cliniquement ^certainement des caractéristiques. Par conséquent, ce modèle de TE peut^certainement être exploité pour disséquer, les facteurs cellulaires autonomes leur permettant de résister à l'attaque cellulaire à médiation immunitaire.

Introduction

Une étape de limitation de taux clé dans l'expression de presque tous les gènes actifs est la transition de la polymérase D'ARN II (ARN Pol II) de la pause promoteur-proximale à l'allongement productif^1,2. Étant donné que la dysrégulation épigénétique de l'allongement transcriptionnel aide à la progression de multiples malignités humaines définies comme TE^{définitivement}, conduisant à la signalisation sous-optimale dans les voies de réponse pro-inflammatoires équivalant à une mauvaise réponse et les résultats à l'immunothérapie³, l'objectif global de ce protocole est d'établir....

Protocole

Le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux et le Comité institutionnel de biosécurité de la Cincinnati Children's Research Foundation ont approuvé toutes les procédures expérimentales pour animaux (protocole de l'IACUC #2017-0061 et protocole du BAC #IBC2016-0016), et ces des expériences ont été menées conformément aux normes décrites dans le Guide des NIH sur les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire.

1. Inhibition chronique de l'ARN Pol II par traitement flavopiridol—stratégie de base

1. Cellules de mélanome de souris de graine B16/F10 dans la basse densité (0.2 x 10⁶) dans une plaque de c....

Résultats

Ici, nous fournissons un schéma détaillé (Figure 1) pour établir un modèle TE^{définitivement} cellulaire obtenu par le traitement sous-étalon-léjon chronique (figure 2) avec flavopiridol à 25 nM. Dans la figure 3, sur 3 jours de traitement avec flavopiridol, B16 ova cellules montrent des caractéristiques partielles de TE^{certainement,} mais après une semaine de traitement, B16/F10 o.......

Discussion

Le contrôle de l'allongement de l'ARN Pol II est apparu comme un levier décisif pour réguler l'expression des gènes sensibles au stimulus au profit des cellules malignes^5,7,8. Surmonter promoteur-proximal pause à l'allongement et la production d'ARNm ultérieure nécessite l'activité kinase de P-TEFb^9,10,11. Notre modèle utilise le flavop.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
hhis6FasL	Cell Signaling	5452
10X TBS	Bio-Rad	170-6435
Plaques 12 puits	Falcon	353043
20 % méthanol	Fisher Chemical	A412-4
Plaques 24 puits	Falcon	351147
4&ndash ; 18 % SDS polyacrylamide gel	Bio-Rad	4561086
4 % paraformaldéhyde	Thermo Fisher Scientific	AAJ19943K2
5 % lait en poudre	Bio-Rad	170-6404
7-méthylguanosine	anticorps BioVision	6655-30T
96 puits	plaques Cellstar	655180
AF647 souris conjuguée CD8	Biolegend
antibiotique et antimycosique	Gibco	15240-062
anticorps anti-His	Signalisation cellulaire	2366&thinsp ; P
Signalisation cellulaire	anti-Rabit	7074	Dilution 1:5000
Signalisation	anti-rat	7077S	Dilution 1:5000
Kit de test Bradford	Bio-Rad	5000121
BSA	ACROS Organics	24040-0100
souris conjuguée BV421 CD45	Biolegend	109831
violet cristallin	Sigma	C3886-100G
DMEM	Gibco	11965-092
Dynabeads Oligo (dT)25	Ambion	61002
FBS	Gibco	45015
Fixable Live/Dead colorant colorant e780	eBioscience	65-0865-14
Flavopiridol	Selleckchem	S1230
H3k36me3	Abcam	ab9050	Dilution 1:2000
IFN-&alpha ;	R& D systèmes	12100-1
IFN-&gamma ;	R& D systems	485-MI-100
IMDM	Gibco	12440053
Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrat	Millipore	WBKLS0500
MojoSort Souris CD8 T Cell Isolation Kit	Biolegend	480007
NF-&kappa ;	Signalisation des cellules	8242s	Dilution 1:1000
PBS	Gibco	14190-144
p-NF-&kappa ; Signalisation	des cellules	3033s	Dilution 1:1000
p-Ser2-RNAPII	Motif actif	61083	Dilution 1:500
P-Ser5-RNAPII	Motif actif	61085	Dilution 1:1000
p-STAT1	Signalisation cellulaire	7649s	Dilution 1:1000
RiboMinu Eucaryote Kit Ambion		A10837-08
Tampon RIPA	Santa Cruz Biotechnologie	sc-24948
RNAPII	Motif actif	61667	Dilution 1:1000
STAT1	Signalisation cellulaire	9175s	Dilution 1:1000
TNF-&alpha ;	R& D systems	410-MT-010
total H3	Signalisation cellulaire	4499	Dilution 1:2000
Tri réactif	Sigma	T9424
Triton	Sigma	T8787-50ML
Tween 20	AA Hoefer	9005-64-5
&beta ;-Actin	Signalisation cellulaire	12620S	Dilution 1:5000
&beta ;-ME	G Biosciences	BC98

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