تصور سطح T-خلية مستقبلات ديناميات رباعية الأبعاد باستخدام شعرية الضوء ورقة المجهر
Summary
الهدف من هذا البروتوكول هو إظهار كيفية استخدام المجهر ورقة الضوء شعرية لأربعة الأبعاد تصور ديناميات مستقبلات السطح في الخلايا الحية. هنا يتم عرض مستقبلات الخلايا التائية على CD4+ الخلايا التائية الأولية.
Abstract
يتم إملاء الإشارات ووظيفة الخلية من خلال الهياكل الديناميكية والتفاعلات لمستقبلات سطحها. لفهم العلاقة بين الهيكل والوظيفة لهذه المستقبلات في الموقع ، نحتاج إلى تصوروتتبعها على سطح الخلية الحية بدقة زمنية مكانية كافية. هنا نعرض كيفية استخدام التي تم تطويرها مؤخرا Lattice ضوء ورقة المجهر (LLSM) لصورة مستقبلات الخلايا التائية (TCRs) رباعية الأبعاد (4D، والمكان والزمان) في غشاء الخلية الحية. الخلايا التائية هي واحدة من الخلايا الفعالة الرئيسية في الجهاز المناعي التكيفي ، وهنا استخدمنا الخلايا التائية كمثال لإظهار أن إشارات ووظيفة هذه الخلايا مدفوعة بديناميكيات وتفاعلاتTCRs. LLSM يسمح للتصوير 4D مع قرار الزمانية المكانية لم يسبق لها مثيل. وبالتالي يمكن تطبيق هذه التقنية المجهرية عموما على مجموعة واسعة من الجزيئات السطحية أو داخل الخلايا من خلايا مختلفة في علم الأحياء.
Introduction
كانت الديناميكيات الدقيقة لتهريب الجزيئات ونشرها على سطح الخلية ثلاثية الأبعاد في الوقت الحقيقي لغزًا يجب حله. كان المجهر دائما ً توازناً بين السرعة والحساسية والدقة. إذا تم تكبير أي واحد أو اثنين، يتم تصغير الثالث. ولذلك، ونظرا لصغر الحجم والسرعة الهائلة التي تتحرك بها مستقبلات السطح، ظل تتبع دينامياتها يشكل تحديا تكنولوجيا رئيسيا في مجال بيولوجيا الخلايا. على سبيل المثال ، تم إجراء العديد من الدراسات باستخدام الانعكاس الداخلي الكلي (TIRF) المجهر1،2،3، الذي له دقة زمنية عالية ، ولكن يمكن أن صورة فقط شريحة رقيقة جدا من غشاء الخلية التائية (~ 100 نانومتر) ، وبالتالي يخطئ الأحداث التي تحدث بعيدا في الخلية. هذه الصور TIRF أيضا عرض فقط قسم ثنائي الأبعاد من الخلية. وعلى النقيض من ذلك، فإن تقنيات الدقة الفائقة، مثل المجهر المجهري لإعادة الإعمار البصري العشوائي (STORM)4،والمجهر المجهري للتعريب المُفعَّل ضوئيًا (PALM)5،والمجهر المنفّز لاستنفاد الانبعاثات (STED)6،يمكنها التغلب على حد حيود Abbe للضوء. هذه التقنيات لديها دقة مكانية عالية (~ 20 نانومتر القرار)4،5،6،7، لكنها غالبا ما تستغرق عدة دقائق للحصول على كامل ثنائي الأبعاد (2D) أو ثلاثي الأبعاد (3D) صورة ، وبالتالي يتم فقدان القرار الزمني. بالإضافة إلى ذلك ، قد يكون تقنيات مثل STORM و PALM التي تعتمد على إشارات وامضة غير دقيقة في عد8،9. المجهر الإلكتروني لديه حتى الآن أعلى دقة (تصل إلى 50 مساء القرار)10; حتى أنه يمكن إجراء ثلاثي الأبعاد مع شعاع أيون مركزة المسح المجهري الإلكترون (FIB-SEM)، مما أدى إلى ما يصل إلى 3 نانومتر XY و 500 نانومتر Z القرار11. ومع ذلك ، فإن أي شكل من أشكال المجهر الإلكتروني يتطلب إعداد عينة قاسية ولا يمكن إجراؤه إلا مع خلايا أو أنسجة ثابتة ، مما يلغي إمكانية تصوير العينات الحية بمرور الوقت.
تقنيات للحصول على دقة الزهوية الزمنية العالية المطلوبة لتحديد ديناميات الجزيئات السطحية وداخل الخلايا في الخلايا الحية في طبيعتها الفسيولوجية الحقيقية 3D يجري تطويرها مؤخرا. واحدة من هذه التقنيات هي Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM)12، والتي تستخدم ورقة ضوء منظمة لخفض التبييض الضوئي بشكل كبير. وضعت في عام 2014 من قبل الحائز على جائزة نوبل اريك Betzig، ودقة محورية عالية، انخفاض photobleaching والضوضاء الخلفية، والقدرة على صورة في وقت واحد مئات من الطائرات لكل مجال من مجالات الرؤية جعل المجاهر LLS متفوقة على widefield، TIRF والمجاهر كونكترسي12،13،14،15،16،17،19. هذه التقنية التصوير رباعية الأبعاد (س، ذ، ض والوقت)، في حين لا يزال الحيود محدودة (~ 200 نانومتر XYZ القرار)، لديه قرار زمني لا يصدق (حققنا معدل الإطار من حوالي 100 إطارا في الثانية، مما أدى إلى صورة خلية 3D أعيد بناؤها مع 0.85 ثانية لكل إطار) للحصول على المكانية 3D.
يمكن استخدام LLSM بشكل عام لتتبع ديناميكيات الوقت الحقيقي لأي جزيئات داخل أي خلية على مستوى الجزيء الواحد والخلية الواحدة ، خاصة تلك الموجودة في الخلايا عالية التفحص مثل الخلايا المناعية. على سبيل المثال، نعرض هنا كيفية استخدام LLSM لتصور ديناميات مستقبلات الخلايا التائية (TCR). الخلايا التائية هي الخلايا الفعالة في الجهاز المناعي التكيفي. TCRs هي المسؤولة عن الاعتراف ligands الببتيد-MHC (pMHC) المعروضة على سطح الخلايا المضادة (APC)، الذي يحدد اختيار، والتنمية، والتمايز، ومصير، وظيفة خلية T. يحدث هذا الاعتراف في الواجهة بين الخلايا التائية وAPCs ، مما يؤدي إلى تجميع مستقبلات موضعية لتشكيل ما يسمى المشبك المناعي. في حين أنه من المعروف أن TCRs في المشبك المناعي ضرورية لوظيفة المؤثرات الخلايا التائية، لا تزال غير معروفة هي الآليات الأساسية للاتجار TCR في الوقت الحقيقي إلى المشبك. وقد سمحت لنا LLSM لتصور في الوقت الحقيقي ديناميات TCRs قبل وبعد الاتجار إلى المشبك مع التفاعل pMHC-TCR الناتجة(الشكل 1). ولذلك يمكن استخدام LLSM لحل الأسئلة الحالية للديناميات التكوينية لـ TCRs وتوفير رؤى لفهم كيفية تميز الخلية بين المستضدات الذاتية والأجنبية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم تحسين البروتوكول المقدم لاستخدام خلايا CD4+ T المعزولة من 5C. C7 الفئران المعدلة وراثيا على أداة LLSM المستخدمة، وبالتالي أنظمة الخلايا الأخرى وLLSMs قد تحتاج إلى تحسين بشكل مختلف. ومع ذلك ، يظهر هذا البروتوكول قوة التصوير 4D ، حيث يمكن استخدامه لقياس ديناميات مستقبلات السطح على خلية كاملة…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن ننوه بالمشورة والتوجيه من الدكتور فيتاس بيندوكاس في جامعة شيكاغو. نشكر المرفق الأساسي للمجهر الضوئي المتكامل في جامعة شيكاغو لدعمه والحفاظ على مجهر ورقة الضوء الشبكية. تم دعم هذا العمل من قبل جائزة المعاهد القومية للصحة الجديدة للمبتكر1DP2AI144245 وجائزة NSF المهنية 1653782 (إلى J.H.). يتم دعم J.R. من قبل برنامج زمالات أبحاث الدراسات العليا NSF.
Materials
| 1 mL Syringe | BD | 309659 | For T cell harvest |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148-25ML | For T cell culture |
| 5 mm round coverslips | World Precision Instruments | 502040 | For Imaging |
| 70um Sterile Cell Strainer | Corning | 7201431 | For T cell harvest |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse TCR β chain Antibody | BioLegend | 109215 | For Imaging |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | X&Y Cell Culture | FBS-500 | For T cell culture |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | Denisty gradient reagent for T cell harvest |
| Fluorescein sodium salt | Sigma-Aldrich | F6377 | For microscope alignment |
| FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres | Thermo Fisher Scientific | F8810 | For microscope alignment |
| Imaris | Bitplane | N/A | Tracking Software; Other options for tracking software include Amira or Trackmate (Fiji). |
| Lattice Light-Sheet Microscope | 3i | N/A | Microscope Used |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 21083027 | For Imaging |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | For T cell culture |
| LLSpy | Janelia Research Campus | N/A | LLSpy was used under license from Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus. Contact innovation@janelia.hhmi.org for access. Other deconvolution and deksewing methods are available in image processing softwares such as Fiji, Slidebook, Amira, and others. https://llspy.readthedocs.io/en/latest/ |
| Moth Cytochrome C (MCC), sequence ANERADLIAYLKQATK | Elimbio | Custom Synthesis | For T cell harvest |
| Penacillin/Streptamycin | Life Technologies | 15140122_3683884612 | For T cell culture |
| Poly-L-Lysine | Phenix Research Products | P8920-100ML | For Imaging |
| RBC Lysis Buffer | eBioscience | 00-4300-54 | For T cell harvest |
| Recombinant mouse IL-2 | Sigma-Aldrich | I0523 | For T cell culture |
| RPMI 1640 Medium | Corning | MT10040CV | For T cell culture |
| Slidebook | 3i | N/A | LLSM imaging software |
| Surgical Dissection Tools | Nova-Tech International | DSET10 | For T cell harvest |
| T-25 Flasks | Eppendorf | 2231710126 | For T cell culture |
| Thermo Scientific Pierce Fab Micro Preparation Kits | Thermo Fisher Scientific | 44685 | For preparing Fab |
References
- Poulter, N. S., Pitkeathly, W. T. E., Smith, P. J., Rappoport, J. Z. The Physical Basis of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy and Its Cellular Applications. Methods in Molecular Biology. 1251, 1-23 (2015).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123, 3621-3628 (2010).
- Axelrod, D. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Methods in Cell Biology. 89, 169-221 (2008).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780 (1994).
- Shroff, H., White, H., Betzig, E. Photoactivated Localization Microscopy (PALM) of Adhesion Complexes. Current Protocols in Cell Biology. 58 (1), 1-28 (2013).
- Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. Imaging Live-Cell Dynamics and Structure at the Single-Molecule Level. Molecular Cell. 58 (4), 644-659 (2015).
- Ji, N., Shroff, H., Zhong, H., Betzig, E. Advances in the speed and resolution of light microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 18 (6), 605-616 (2008).
- . Atomic Resolution Imaging with a sub-50 pm Electron Probe Available from: https://escholarship.org/uc/item/3cs0m4vr (2019)
- Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. Focused ion beam scanning electron microscopy in biology. Journal of Microscopy. 254 (3), 109-114 (2014).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. , (2014).
- Ni, J., et al. Adoptively transferred natural killer cells maintain long-term antitumor activity by epigenetic imprinting and CD4+ T cell help. Oncoimmunology. 5 (9), 1219009 (2016).
- Chaudhri, A., Xiao, Y., Klee, A. N., Wang, X., Zhu, B., Freeman, G. J. PD-L1 Binds to B7-1 Only In Cis on the Same Cell Surface. Cancer Immunology Research. 6 (8), 921-929 (2018).
- Forbes, C. A., Scalzo, A. A., Degli-Esposti, M. A., Coudert, J. D. Ly49C-dependent control of MCMV Infection by NK cells is cis-regulated by MHC Class I molecules. PLoS pathogens. 10 (5), 1004161 (2014).
- Schöneberg, J., et al. 4D cell biology: big data image analytics and lattice light-sheet imaging reveal dynamics of clathrin-mediated endocytosis in stem cell-derived intestinal organoids. Molecular biology of the cell. 29 (24), 2959-2968 (2018).
- Gao, R., et al. Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution. Science. 363 (6424), 8302 (2019).
- Cai, E., et al. Visualizing dynamic microvillar search and stabilization during ligand detection by T cells. Science. 356 (6338), 3118 (2017).
- Ritter, A. T., et al. Actin Depletion Initiates Events Leading to Granule Secretion at the Immunological Synapse. Immunity. , (2015).
- Lim, J. F., Berger, H., Su, I. -. H. Isolation and Activation of Murine Lymphocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. (116), e54596 (2016).
- Huang, J., et al. A Single Peptide-Major Histocompatibility Complex Ligand Triggers Digital Cytokine Secretion in CD4+ T Cells. Immunity. 39 (5), 846-857 (2013).
- Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. Direct observation of ligand recognition by T cells. Nature. 419 (6909), 845-849 (2002).
- Jansson, A. A mathematical framework for analyzing T cell receptor scanning of peptides. Biophysical journal. 99 (9), 2717-2725 (2010).
- Mickoleit, M., et al. High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart. Nature Methods. 11 (9), 919-922 (2014).
