Visualisation de la dynamique des récepteurs T-Cell de surface à quatre dimensions à l'aide de microscopie à feuilles de lumière en treillis
Summary
Le but de ce protocole est de montrer comment utiliser la microscopie lattice Light-Sheet pour visualiser en quatre dimensions la dynamique des récepteurs de surface dans les cellules vivantes. Ici, les récepteurs des lymphocytes T sur les lymphocytes T CD4et primaires sont montrés.
Abstract
La signalisation et la fonction d’une cellule sont dictées par les structures dynamiques et les interactions de ses récepteurs de surface. Pour vraiment comprendre la relation structure-fonction de ces récepteurs in situ, nous devons les visualiser et les suivre sur la surface des cellules vivantes avec une résolution spatiotemporal suffisante. Ici, nous montrons comment utiliser récemment développé Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM) pour l’image des récepteurs à cellule T (TCRs) en quatre dimensions (4D, l’espace et le temps) à la membrane cellulaire vivante. Les lymphocytes T sont l’une des principales cellules effectrices du système immunitaire adaptatif, et ici nous avons utilisé les lymphocytes T comme exemple pour montrer que la signalisation et la fonction de ces cellules sont entraînées par la dynamique et les interactions des TCR. LLSM permet une imagerie 4D avec une résolution spatiotemporal sans précédent. Cette technique de microscopie peut donc être généralement appliquée à un large éventail de molécules de surface ou intracellulaires de différentes cellules en biologie.
Introduction
La dynamique précise du trafic et de la diffusion des molécules sur la surface tridimensionnelle des cellules en temps réel a été une énigme à résoudre. La microscopie a toujours été un équilibre de vitesse, de sensibilité et de résolution; si un ou deux sont maximisés, le troisième est minimisé. Par conséquent, en raison de la petite taille et de la vitesse immense avec laquelle les récepteurs de surface se déplacent, le suivi de leur dynamique est resté un défi technologique majeur dans le domaine de la biologie cellulaire. Par exemple, de nombreuses études ont été menées à l’aide de la microscopie interne totale de fluorescence (TIRF)1,2,3, qui a une résolution temporelle élevée, mais ne peut imager qu’une tranche très mince de la membrane des lymphocytes T (100 nm), et manque donc des événements qui se produisent plus loin dans la cellule. Ces images TIRF ne montrent également qu’une section bidimensionnelle de la cellule. En revanche, les techniques de super-résolution, telles que la microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM)4, la microscopie de localisation photoactivée (PALM)5, et la microscopie d’épuisement des émissions stimulée (STED)6, peuvent surmonter la limite de diffraction de l’abbéenne de la lumière. Ces techniques ont une résolution spatiale élevée (résolution de 20 nm)4,5,6,7, mais elles prennent souvent de nombreuses minutes pour acquérir une image bidimensionnelle complète (2D) ou tridimensionnelle (3D), et donc la résolution temporelle est perdue. En outre, des techniques telles que STORM et PALM qui reposent sur des signaux clignotants peuvent avoir des inexactitudes dans le comptage8,9. La microscopie électronique a de loin la plus haute résolution (jusqu’à 50 h de résolution)10; il peut même être effectué en trois dimensions avec la microscopie électronique focalisée de balayage de faisceau d’ions (FIB-SEM), ayant pour résultat jusqu’à 3 nm XY et 500 nm Z résolution11. Cependant, toute forme de microscopie électronique nécessite une préparation d’échantillons rigoureux et ne peut être menée qu’avec des cellules ou des tissus fixes, éliminant ainsi la possibilité d’imagerie d’échantillons vivants au fil du temps.
Les techniques pour obtenir la résolution spatiotemporal élevée exigée pour identifier la dynamique des molécules de surface et intracellulaires dans les cellules vivantes dans leur vraie nature physiologique 3D sont seulement récemment développées. Une de ces techniques est Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM)12, qui utilise une feuille de lumière structurée pour réduire considérablement photoblanchiment. Développé en 2014 par le prix Nobel Eric Betzig, la haute résolution axiale, le faible photoblanchiment et le bruit de fond, et la capacité d’imager simultanément des centaines d’avions par champ de vision font des microscopes LLS supérieurs aux microscopes widefield, TIRF et confocal12,13,14,15,16,17,18,19. Cette technique d’imagerie en quatre dimensions (x, y, z et temps), bien que toujours limitée à la diffraction (résolution XYZ de 200 nm), a une résolution temporelle incroyable (nous avons atteint un taux d’image d’environ 100 fps, résultant en une image cellulaire reconstruite en 3D avec 0,85 seconde par image) pour l’acquisition spatiale 3D.
LLSM peut généralement être utilisé pour suivre la dynamique en temps réel de toutes les molécules dans n’importe quelle cellule au niveau monomolécule et unicellulaire, en particulier ceux dans les cellules très motiles telles que les cellules immunitaires. Par exemple, nous montrons ici comment utiliser LLSM pour visualiser la dynamique des récepteurs des lymphocytes T (TCR). Les lymphocytes T sont les cellules effectrices du système immunitaire adaptatif. Les TCR sont chargés de reconnaître les ligands peptide-MHC (pMHC) affichés à la surface des cellules présentant des antigènes (APC), qui déterminent la sélection, le développement, la différenciation, le sort et la fonction d’une cellule T. Cette reconnaissance se produit à l’interface entre les lymphocytes T et les APC, résultant en un regroupement localisé des récepteurs pour former ce qu’on appelle la synapse immunologique. Bien qu’il soit connu que les TCR à la synapse immunologique sont impératifs pour la fonction effector de Cellule T, encore inconnus sont les mécanismes sous-jacents du trafic en temps réel de TCR à la synapse. LLSM nous a permis de visualiser en temps réel la dynamique des TCR avant et après le trafic à la synapse avec l’interaction pMHC-TCR qui en résulte (Figure 1). LLSM peut donc être utilisé pour résoudre les questions actuelles de la dynamique formatrice des TCR et fournir des idées pour comprendre comment une cellule fait la distinction entre l’individu et les antigènes étrangers.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole présenté a été optimisé pour l’utilisation des cellules CD4et T isolées de 5C. Les souris transgéniques C7 sur l’instrument LLSM utilisé, et donc d’autres systèmes cellulaires et LLSM peuvent avoir besoin d’être optimisés différemment. Cependant, ce protocole montre la puissance de l’imagerie 4D, car il peut être utilisé pour quantifier la dynamique d’un récepteur de surface sur une cellule entière avec le moins de distorsion dans les conditions physiologiques. Par conséquent, il …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à souligner les conseils et les conseils du Dr Vytas Bindokas de l’Université de Chicago. Nous remercions l’Integrated Light Microscopy Core Facility de l’Université de Chicago d’avoir soutenu et entretenu le microscope à feuilles de lumière en treillis. Ce travail a été soutenu par NIH New Innovator Award 1DP2AI144245 et NSF Career Award 1653782 (To J.H.). J.R. est soutenu par le NSF Graduate Research Fellowships Program.
Materials
| 1 mL Syringe | BD | 309659 | For T cell harvest |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148-25ML | For T cell culture |
| 5 mm round coverslips | World Precision Instruments | 502040 | For Imaging |
| 70um Sterile Cell Strainer | Corning | 7201431 | For T cell harvest |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse TCR β chain Antibody | BioLegend | 109215 | For Imaging |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | X&Y Cell Culture | FBS-500 | For T cell culture |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | Denisty gradient reagent for T cell harvest |
| Fluorescein sodium salt | Sigma-Aldrich | F6377 | For microscope alignment |
| FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres | Thermo Fisher Scientific | F8810 | For microscope alignment |
| Imaris | Bitplane | N/A | Tracking Software; Other options for tracking software include Amira or Trackmate (Fiji). |
| Lattice Light-Sheet Microscope | 3i | N/A | Microscope Used |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 21083027 | For Imaging |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | For T cell culture |
| LLSpy | Janelia Research Campus | N/A | LLSpy was used under license from Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus. Contact innovation@janelia.hhmi.org for access. Other deconvolution and deksewing methods are available in image processing softwares such as Fiji, Slidebook, Amira, and others. https://llspy.readthedocs.io/en/latest/ |
| Moth Cytochrome C (MCC), sequence ANERADLIAYLKQATK | Elimbio | Custom Synthesis | For T cell harvest |
| Penacillin/Streptamycin | Life Technologies | 15140122_3683884612 | For T cell culture |
| Poly-L-Lysine | Phenix Research Products | P8920-100ML | For Imaging |
| RBC Lysis Buffer | eBioscience | 00-4300-54 | For T cell harvest |
| Recombinant mouse IL-2 | Sigma-Aldrich | I0523 | For T cell culture |
| RPMI 1640 Medium | Corning | MT10040CV | For T cell culture |
| Slidebook | 3i | N/A | LLSM imaging software |
| Surgical Dissection Tools | Nova-Tech International | DSET10 | For T cell harvest |
| T-25 Flasks | Eppendorf | 2231710126 | For T cell culture |
| Thermo Scientific Pierce Fab Micro Preparation Kits | Thermo Fisher Scientific | 44685 | For preparing Fab |
References
- Poulter, N. S., Pitkeathly, W. T. E., Smith, P. J., Rappoport, J. Z. The Physical Basis of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy and Its Cellular Applications. Methods in Molecular Biology. 1251, 1-23 (2015).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123, 3621-3628 (2010).
- Axelrod, D. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Methods in Cell Biology. 89, 169-221 (2008).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780 (1994).
- Shroff, H., White, H., Betzig, E. Photoactivated Localization Microscopy (PALM) of Adhesion Complexes. Current Protocols in Cell Biology. 58 (1), 1-28 (2013).
- Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. Imaging Live-Cell Dynamics and Structure at the Single-Molecule Level. Molecular Cell. 58 (4), 644-659 (2015).
- Ji, N., Shroff, H., Zhong, H., Betzig, E. Advances in the speed and resolution of light microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 18 (6), 605-616 (2008).
- . Atomic Resolution Imaging with a sub-50 pm Electron Probe Available from: https://escholarship.org/uc/item/3cs0m4vr (2019)
- Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. Focused ion beam scanning electron microscopy in biology. Journal of Microscopy. 254 (3), 109-114 (2014).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. , (2014).
- Ni, J., et al. Adoptively transferred natural killer cells maintain long-term antitumor activity by epigenetic imprinting and CD4+ T cell help. Oncoimmunology. 5 (9), 1219009 (2016).
- Chaudhri, A., Xiao, Y., Klee, A. N., Wang, X., Zhu, B., Freeman, G. J. PD-L1 Binds to B7-1 Only In Cis on the Same Cell Surface. Cancer Immunology Research. 6 (8), 921-929 (2018).
- Forbes, C. A., Scalzo, A. A., Degli-Esposti, M. A., Coudert, J. D. Ly49C-dependent control of MCMV Infection by NK cells is cis-regulated by MHC Class I molecules. PLoS pathogens. 10 (5), 1004161 (2014).
- Schöneberg, J., et al. 4D cell biology: big data image analytics and lattice light-sheet imaging reveal dynamics of clathrin-mediated endocytosis in stem cell-derived intestinal organoids. Molecular biology of the cell. 29 (24), 2959-2968 (2018).
- Gao, R., et al. Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution. Science. 363 (6424), 8302 (2019).
- Cai, E., et al. Visualizing dynamic microvillar search and stabilization during ligand detection by T cells. Science. 356 (6338), 3118 (2017).
- Ritter, A. T., et al. Actin Depletion Initiates Events Leading to Granule Secretion at the Immunological Synapse. Immunity. , (2015).
- Lim, J. F., Berger, H., Su, I. -. H. Isolation and Activation of Murine Lymphocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. (116), e54596 (2016).
- Huang, J., et al. A Single Peptide-Major Histocompatibility Complex Ligand Triggers Digital Cytokine Secretion in CD4+ T Cells. Immunity. 39 (5), 846-857 (2013).
- Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. Direct observation of ligand recognition by T cells. Nature. 419 (6909), 845-849 (2002).
- Jansson, A. A mathematical framework for analyzing T cell receptor scanning of peptides. Biophysical journal. 99 (9), 2717-2725 (2010).
- Mickoleit, M., et al. High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart. Nature Methods. 11 (9), 919-922 (2014).
