Optimización, diseño y evitamiento de trampas en la inmunohistoquímica fluorescente multiplexación manual
Summary
La inmunohistoquímica fluorescente multiplex es una tecnología emergente que permite la visualización de múltiples tipos de células dentro del tejido integrado en parafina (FFPE) fijo en formalina. Se presentan pautas para asegurar un multiplex de 7 colores exitoso con instrucciones para optimizar anticuerpos y reactivos, preparar diapositivas, diseño y consejos para evitar problemas comunes.
Abstract
La evaluación del microambiente del tejido intacto para el análisis de la infiltración celular y la organización espacial son esenciales para comprender la complejidad de los procesos de la enfermedad. Las técnicas principales utilizadas en el pasado incluyen inmunohistoquímica (IHC) e inmunofluorescencia (IF) que permiten la visualización de las células como una instantánea en el tiempo utilizando entre 1 y 4 marcadores. Ambas técnicas tienen deficiencias, incluida la dificultad para manchar objetivos malgénicos y limitaciones relacionadas con la reactividad entre especies. IHC es confiable y reproducible, pero la naturaleza de la química y la dependencia del espectro de luz visible permite utilizar sólo unos pocos marcadores y hace que la colocalización sea un reto. El uso de IF amplía los marcadores potenciales, pero normalmente se basa en el tejido congelado debido a la extensa autofluorescencia del tejido después de la fijación de formalina. La citometría de flujo, una técnica que permite el etiquetado simultáneo de múltiples epítopos, deroga muchas de las deficiencias de IF e IHC, sin embargo, la necesidad de examinar las células como una suspensión de una sola célula pierde el contexto espacial de las células que descartan Relaciones. La inmunohistoquímica fluorescente multiplex (mfIHC) puentes de estas tecnologías que permiten el fenotipado celular multiepitope en tejido de parafina fija inhacina (FFPE) de formalina, preservando al mismo tiempo la arquitectura general del microambiente y el espacio relación de las células dentro del tejido intacto no interrumpido. Los fluoróforos de alta intensidad fluorescente que se unen covalentemente al epítopo tisular permiten múltiples aplicaciones de anticuerpos primarios sin preocuparse de la reactividad cruzada específica de la especie por anticuerpos secundarios. Aunque se ha demostrado que esta tecnología produce imágenes fiables y precisas para el estudio de enfermedades, el proceso de creación de una estrategia de tinción mfIHC útil puede llevar mucho tiempo y ser exigente debido a la amplia optimización y diseño. Con el fin de hacer imágenes robustas que representen interacciones celulares precisas in situ y para mitigar el período de optimización para el análisis manual, presentados aquí son métodos para la preparación de diapositivas, optimización de anticuerpos, diseño multiplex, así como errores, así como errores comúnmente durante el proceso de tinción.
Introduction
La visualización de un microambiente tumoral intacto (TME) es esencial para evaluar no sólo la infiltración celular en neoplasias malignas sólidas, sino también las interacciones de células a células. La inmunohistoquímica fluorescente multiplex (mfIHC) ha surgido como una herramienta eficaz para el fenotipado multiantígeno de células en el estudio del cáncer y las enfermedades asociadas1,2,3,4, 5,6,7. Esto, en combinación con nuevos programas y software diseñados para analizargrandes conjuntos de datos, permite la observación de interacciones complejas entre las células 1,2,4. El factor limitante de la velocidad en la adquisición de datos es a menudo la calidad del tejido manchado antes del análisis.
Las técnicas anteriores utilizadas para las células fenotipo en el TME incluyen inmunohistoquímica (IHC), inmunofluorescencia (IF) y citometría de flujo, todas las cuales presentan limitaciones significativas. IHC utiliza secciones de tejido de parafina fija incrustada de formalina (FFPE) que se deparan y rehidratan antes de ser manchadas por la mayoría de las veces un anticuerpo. El uso de un anticuerpo secundario ligado a la peroxidasa de rábano picante(HRP) y una reacción química permite la visualización de un solo epítopo antigénico 8. Mientras que IHC es confiable y se realiza en el tejido FFPE que es fácil de trabajar con, limitaciones al espectro de luz visible significa que sólo uno o dos marcadores pueden ser confiables distinguidos y la colocación de antígenos bastante difícil8. Una forma de ampliar los marcadores disponibles y, por lo tanto, los antígenos que se pueden sondear en una sola sección es cambiar a fluorescencia que permite el uso de una gama más amplia del espectro visual. Para IF, el tejido congelado o FFPE se transfiere a diapositivas y anticuerpos utilizados que se conjugan a varios fluoróforos. Si bien esto aumenta el número de antígenos que se pueden sondear, hay varias limitaciones importantes. En primer lugar, debido a que cada anticuerpo normalmente sólo tiene un fluoróforo unido, el brillo a menudo no es lo suficientemente fuerte como para superar la autofluorescencia tisular. Es por esta razón, la mayoría de IF se realiza en tejido congelado que es caro de almacenar y difícil de trabajar con. Un número limitado de etiquetas fluorescentes están disponibles para su uso debido a la superposición espectral y la reactividad de las especies cruzadas, especialmente cuando se utilizan anticuerpos no conjugados. La citometría de flujo, que consiste en el procesamiento de tejido fresco en una suspensión de una solacélula y el etiquetado con anticuerpos fluorescentes ha sido el estándar de oro para el inmunofenotipado durante décadas 9,10. Un beneficio de la citometría de flujo es la capacidad de etiquetar múltiples anticuerpos sin preocupación por la reactividad cruzada de las especies, ya que la mayoría se conjugan. Debido a que las células son “visualizadas” por una máquina y no los ojos humanos, hay muchos más fluoróforos disponibles, pero esto tiene un costo. La compensación debe hacerse manualmente, lo que puede alterar significativamente los resultados produciendo poblaciones falsas positivas y negativas. La limitación más significativa de la citometría de flujo es que la arquitectura tisular y posteriormente toda la información espacial se pierde por la necesidad de la suspensión de células individuales.
La inmunohistoquímica fluorescente multiplex (mfIHC) utilizando un microscopio fluorescente automatizado en combinación con un software novedoso combina los beneficios de IHC, IF y la citometría de flujo al permitir la tinción de tejido multiantígeno con amplificación de señal y retención de relaciones espaciales sin necesidad de compensación. El tejido FFPE se coloca en diapositivas cargadas que, después de la recuperación del antígeno, se someten a una ronda de aplicación de anticuerpos primarios al antígeno objetivo de interés seguido de un anticuerpo secundario con una etiqueta química HRP, similar a IHC. Después de la colocación del anticuerpo secundario, una reacción específica de HRP da como resultado una unión covalente de fluoróforo al epítopo de interés11. Una vez que el tejido está etiquetado, se completa otra ronda de calentamiento de las diapositivas eliminando el complejo de anticuerpos primarios y secundarios previamente aplicados dejando sólo la etiqueta fluorescente unida al epítopo de tejido11. Esto permite que múltiples anticuerpos de cualquier especie sean reaplicados sin preocupación por la reactividad cruzada11,12. Para minimizar cualquier necesidad de compensación manual de múltiples colorantes fluorescentes, se utiliza una colección de fluoróforos con poca superposición espectral, incluida una mancha de contador nuclear, para completar el mfIHC. Para tener en cuenta la autofluorescencia encontrada con el tejido FFPE, el software resta la autofluorescencia de la imagen final utilizando una imagen de una diapositiva en blanco que es posible debido a la fuerza de fluorescencia específica de antígeno después del fluoróforo amplificación de la señal. Utilizando programas novedosos diseñados para grandes conjuntos de datos, las ubicaciones de celdas se pueden identificar y analizar para el contexto espacial1,2,4. La limitación más significativa de esta técnica es el tiempo de optimización. Una metodología detallada con instrucciones para el diseño experimental y la estrategia de tinción e imagen se encuentra aquí. mfIHC será útil para laboratorios que actualmente no tienen un sistema de tinción automatizado optimizado que le gustaría entender mejor el contexto espacial de las interacciones de célula a célula en el tejido FFPE intacto utilizando la técnica manual.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las muestras de tejido intactas de la biopsia de tumores sólidos y la resección quirúrgica siguen siendo importantes herramientas diagnósticas y predictivas para el análisis de la enfermedad, así como el pronóstico del paciente. La inmunohistoquímica fluorescente multiplex (mfIHC) es una técnica novedosa que combina los beneficios de la inmunohistoquímica (IHC), la inmunofluorescencia (IF) y la citometría de flujo. Los métodos anteriores para sondear las células in situ hanpermitido l…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores quieren agradecer a Ed Stack, anteriormente de Perkin Elmer, por su ayuda con la configuración y optimización de la tinción multiplex original. Los autores también quieren agradecer a Kristen Schmidt de Akoya Biosciences por consejos de uso del software de análisis. La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por los Institutos Nacionales de Salud del Cáncer bajo el Premio Número P30CA046592, K08CA201581(tlf), K08CA234222 (js), R01CA15158807 (mpm), RSG1417301CSM (mpm), R01CA19807403 (mpm), U01CA22414501 (mpm, hc), CA170568 (hc). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud. El apoyo adicional fue proporcionado por Jeffery A. Colby Colon Cancer y Tom Liu Memorial Research Funds.
Materials
| 100% ethanol | Fisher | HC8001GAL | |
| 70% ethanol | Fisher | HC10001GL | |
| 95% ethanol | Fisher | HC11001GL | |
| Analysis software | Akoya Biosciences | CLS135783 | inForm version 2.3.0 |
| Antifade mountant | ThermoFisher | P36961 | ProLong Diamond |
| Blocking solution | Vector | SP-6000 | Bloxall |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Life Sciences | A9647-100G | |
| Cover Slips | Fisher | 12-548-5E | |
| Delicate task wipe | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Fluorescent diluent | Akoya Biosciences | ARD1A01EA | Opal TSA diluent |
| Fluorophore 520 | Akoya Biosciences | FP1487001KT | 1:100 |
| Fluorophore 540 | Akoya Biosciences | FP1494001KT | 1:100 |
| Fluorophore 570 | Akoya Biosciences | FP1488001KT | 1:100 |
| Fluorophore 620 | Akoya Biosciences | FP1495001KT | 1:100 |
| Fluorophore 650 | Akoya Biosciences | FP1496001KT | 1:100 |
| Fluorophore 690 | Akoya Biosciences | FP1497001KT | 1:100 |
| Fluorophore DAPI | Akoya Biosciences | FP1490 | 3 drops in TBST or PBS |
| Heat resistant box | Tissue-Tek | 25608-904 | Plastic slide box-green |
| Humidified Chamber | Ibi Scientific | AT-12 | |
| Hybridization oven | FisherBiotech | ||
| Hydrophobic barrier pen | Vector | H-4000 | ImmEdge |
| Microscope | Perkin Elmer | CLS140089 | Mantra quantitative pathology workstation |
| Microwave | Panasonic | NN-A661S | with inverter technology |
| Neutral buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | 10% neutral buffered formalin |
| pH 6 antigen retrieval buffer | Akoya Biosciences | AR600 | AR6 |
| pH 9 antigen retrieval buffer | Akoya Biosciences | AR900 | AR9 |
| Phosphate buffered saline | Fisher | BP3994 | PBS |
| Plastic slide box | Tissue-Tek | 25608-906 | |
| Plastic wrap | Fisher | NC9070936 | |
| Polysorbate 20 | Fisher | BP337-800 | Tween 20 |
| Primary antibody CD163 | Lecia | NCL-LCD163 | 1:400 |
| Primary antibody CD3 | Dako | A0452 | 1:400 |
| Primary antibody CD8 | Spring Bio | M5390 | 1:400 |
| Primary antibody FOXP3 | Dako | M3515 | 1:400 |
| Primary antibody pancytokeratin | Cell Signaling | 12653 | 1:500 |
| Primary antibody PD-L1 | Cell Signaling | 13684 | 1:200 |
| Secondary antibody | Akoya Biosciences | ARH1001EA | Opal polymer |
| Slide stain set | Electron Microscopy Sciences | 6254001 | |
| Tris buffered saline | Corning | 46-012-CM | TBS |
| Vertical slide rack | Electron Microscopy Sciences | 50-294-72 | |
| Xylene | Fisher | X3P1GAL |
References
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