אופטימיזציה, עיצוב והימנעות החסרונות בתוך מולטיפלקס במגה ומין אימונוהיסטוכימיה
Summary
הטכנולוגיה המתהווה של מולטיפלקס מאפשרת הדמיה של סוגי תאים מרובים בתוך הרקמה הקבועה, שאינה מוטבעת ברקמת פרפין (FFPE). הציגו הם הנחיות להבטחת מולטיפלקס 7-צבע מוצלח עם הוראות אופטימיזציה של נוגדנים וריאגנטים, הכנת שקופיות, עיצוב וטיפים להימנעות בעיות נפוצות.
Abstract
הערכה מיקרוסביבתית של רקמות שלמות לניתוח חדירת תאים וארגון מרחבי הינם חיוניים להבנת המורכבות של תהליכי המחלות. הטכניקות העיקריות המשמשות בעבר כוללות אימונוהיסטוכימיה (IHC) ו immunofluorescence (IF) המאפשרים ויזואליזציה של תאים כתמונה בזמן שימוש בין 1 ל 4 סמנים. לשתי הטכניקות יש חסרונות כולל קושי לצביעת מטרות מנוגדות ומגבלות לא מקושרות הקשורות לפעילות מחודשת במינים. IHC אמינים ומיושנים, אבל הטבע של הכימיה וההסתמכות על ספקטרום האור הנראה מאפשר רק כמה סמנים לשמש והופך שיתוף לוקליזציה מאתגרת. השימוש אם מרחיב סמנים פוטנציאליים אך בדרך כלל מסתמך על רקמות קפואות בשל הרקמה המקיפה של הרקמות האוטומטיות לאחר קיבוע פורמלין. Cy, שיטת זרימה, טכניקה המאפשרת תיוג סימולטני של אפיציסקופים מרובים, abrogates רבים של ליקויים של IF ו-IHC, עם זאת, הצורך לבחון תאים כהשעיה תא יחיד מאבד את ההקשר המרחבי של תאים להשליך ביולוגי חשוב יחסים. מולטיפלקס (mfIHC) מגשר על טכנולוגיות אלה ומאפשר הפנוטיפים סלולריים רב אפיטביים ברקמת פרפין קבוע מוטבע (FFPE) רקמה תוך שמירה על הארכיטקטורה הכוללת של המיקרו-סביבה ומרחבי קשר של תאים. בתוך רקמה שאינה מופרת בחוזק פלורסנט גבוהה fluorophores כי קשר בעוצמה לאפירופה רקמות מאפשר יישומים מרובים של הנוגדנים העיקריים ללא חשש של מינים החוצה פעילות משנית על ידי נוגדנים משני. למרות טכנולוגיה זו הוכח לייצר תמונות אמינות ומדויקות לחקר המחלה, תהליך יצירת אסטרטגיה שימושי mfIHC צביעת יכול להיות זמן רב ומדויק עקב אופטימיזציה ועיצוב נרחב. כדי ליצור תמונות חזקות המייצגות אינטראקציות סלולריות מדויקות באתרו ולהמתיק את תקופת האופטימיזציה לניתוח ידני, מוצגות כאן שיטות להכנת שקופיות, אופטימיזציה של נוגדנים, עיצוב מולטיפלקס, כמו גם שגיאות נתקל בדרך כלל במהלך תהליך הצביעת.
Introduction
ויזואליזציה של מיקרוסביבה הגידול ללא פגע (TME) הוא חיוני בהערכת לא רק חדירה תאית בגידולים ממאירים מוצק אלא גם תא לאינטראקציות תאים. מולטיפלקס אימונוהיסטוכימיה (mfihc) התפתחה ככלי יעיל עבור מולטי אנטיגן פנוויקליד של תאים במחקר של סרטן ומחלות הקשורות1,2,3,4, 5,6,7. זאת, בשילוב עם תוכנות ותוכניות הרומן שנועדו לנתח ערכות נתונים גדולות, מאפשר התבוננות באינטראקציות מורכבות בין תאים1,2,4. גורם הגבלת הקצב ברכישת נתונים הוא לעתים קרובות איכות הרקמה המוכתמת לפני ניתוח.
הטכניקות הקודמות השתמשו כדי להתאים את התאים ב-TME כוללים אימונוהיסטוכימיה (IHC), immunofluorescence (IF) ולזרום cy, שכולם מהווה מגבלות משמעותיות. IHC משתמשת במקטעי פרפין קבועים (FFPE) משובצים ברקמות שאינן מוכתמים לפני הכתם על ידי נוגדן אחד לרוב. השימוש של חזרת peroxidase (HRP) נוגדן משני מאוגד ותגובה כימית מאפשר ויזואליזציה של אפיגניים אחד נגד הגנים8. בעוד IHC הוא אמין ומבוצע על רקמת FFPE אשר קל לעבוד עם, מגבלות על ספקטרום אור גלוי פירושו רק אחד או שניים סמנים יכול להיות אמין מכובד ולוקליזציה של אנטיגנים די קשה8. דרך להרחיב סמנים זמינים ולכן אנטיגנים שניתן לנחקר על מקטע אחד היא לשנות את הזריחה המאפשרת להשתמש במגוון רחב יותר של הספקטרום החזותי. עבור IF, מוקפא או רקמת FFPE מועבר על שקופיות ונוגדנים בשימוש כי הם מושכן fluorophores שונים. בעוד זה מגדיל את מספר אנטיגנים שניתן לנחקר, קיימות מספר מגבלות חשובות. ראשון, כי כל נוגדן בדרך כלל רק מצורף אחד fluorophore הבהירות היא לעתים קרובות לא חזק מספיק כדי להתגבר על הרקמה האוטומטית של רקמות. מסיבה זו, רוב IF מבוצע על רקמות קפואות אשר יקר לאחסן וקשה לעבוד עם. מספר מצומצם של תגי פלורסנט זמינים לשימוש עקב חפיפה ספקטרלית ומינים לחצות פעילות מחודשת במיוחד כאשר נוגדנים לא מצובית משמשים. זרימה cy, אשר מורכב עיבוד רקמות טריות לתוך השעיה תא אחד ותיוג עם נוגדנים פלורסנט היה תקן זהב עבור immunophenotyping קלדה במשך עשורים9,10. היתרון של cytometry זרימה היא היכולת לתייג נוגדנים מרובים בלי לדאוג מינים לחצות פעילות מחדש כמו רוב מצוחים. בגלל התאים הם “דמיינו” על ידי מכונה ולא העיניים האנושיות, יש fluorophores הרבה יותר זמין אבל זה מגיע עם עלות. יש לבצע פיצוי באופן ידני שיכול לשנות באופן משמעותי את התוצאות המייצרות אוכלוסיות חיוביות ושליליות כוזבות. המגבלה המשמעותית ביותר של הזרימה cy, מנסה להיות בארכיטקטורת רקמות ולאחר מכן כל מידע מרחבי אובד על-ידי הצורך עבור תאים בודדים ההשעיה.
באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט אוטומטי בשילוב עם התוכנה הרומן משלבת את היתרונות של ihc, IF וזרימה cy, לנסות על ידי מתן מכתים רקמות רב אנטיגן עם הגברה האות ו שמירה על מערכות יחסים מרחבית ללא צורך בפיצוי. רקמת FFPE מושם על שקופיות טעונה אשר, לאחר אחזור אנטיגן, לעבור סיבוב של יישום הנוגדן העיקרי אנטיגן היעד של עניין ואחריו נוגדן משני עם תג כימי HRP, דומה ל-IHC. לאחר המיקום של הנוגדן המשני, תגובה מסוימת HRP התוצאות מחייב מחייבת fluorophore כריכה האפירופה של ריבית11. לאחר הרקמה מתויג, סיבוב נוסף של חימום השקופיות הושלמה הסרת מורכב הנוגדן העיקרי הקודם והמשני משאיר רק את תג פלורסנט מאוגד לרקמות הרקמה11. הדבר מאפשר למרוח מחדש נוגדנים מרובים של מינים כלשהם מבלי לדאוג לפעילות חוצת-שתיים11,12. כדי למזער כל צורך פיצוי ידני של צבעי פלורסנט מרובים, אוסף של fluorophores עם חפיפה מעט ספקטרלית כולל כתם גרעיני משמש להשלמת mfIHC. כדי להסביר את הגרסה האוטומטית הנתקלת עם רקמת FFPE, התוכנה מפחית את הקרינה האוטומטית מהתמונה הסופית באמצעות תמונה משקופית ריקה האפשרית בגלל כוחה של אנטיגן מסוים של פלואורסצנטית הבאים fluorophore . הגברה של האות שימוש בתוכניות הרומן המיועדות לערכות נתונים גדולות, ניתן לזהות ולנתח מיקומי תאים עבור הקשר מרחבי1,2,4. המגבלה המשמעותית ביותר של טכניקה זו היא זמן אופטימיזציה. מתודולוגיה מפורטת עם הנחיות לתכנון ניסיוני ולצביעת ואסטרטגיית דימות נמצאה כאן. mfIHC יהיה שימושי עבור מעבדות כי לא כרגע יש מערכת ממוטבת מכתים אוטומטית שרוצה להבין טוב יותר את ההקשר המרחבי של האינטראקציה תא לתאים ברקמת FFPE שלמים באמצעות הטכניקה הידנית.
Protocol
Representative Results
Discussion
דגימות רקמה שלמה של ביופסיה הגידול מוצק כריתת כירורגית להישאר כלים אבחון וחיזוי חשוב לניתוח מחלות, כמו גם פרוגנוזה המטופל. מולטיפלקס (mfIHC) היא טכניקה חדשנית המשלבת את היתרונות של אימונוהיסטוכימיה (IHC), immunofluorescence (IF) ולזרום cy,. השיטות הקודמות כדי לחקור את התאים באתרו הורשו הערכה של תא אל התא ה?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות לאד סטאק, בעבר Perkin אלמר, על עזרתו עם התקנה ואופטימיזציה של הצביעת המקורי של הקולנוע. המחברים רוצים גם להודות לקריסטן שמידט מתוך מדעי הביולוגיה לטיפים באמצעות תוכנת הניתוח. מחקרים שדווחו בפרסום זה נתמכים על ידי המכון הלאומי לבריאות הסרטן תחת הפרס מספר P30CA046592, K08CA201581 (tlf), K08CA234222 (js), R01CA15158807 (mpm), RSG1417301CSM (mpm), R01CA19807403 (mpm), U01CA22414501 (mpm, hc), CA170568 (hc). התוכן הינו באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את ההשקפות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות. תמיכה נוספת סופקה על ידי Jeffery A. קולבי קולון סרטן ו טום ליאו מחקר קרנות.
Materials
| 100% ethanol | Fisher | HC8001GAL | |
| 70% ethanol | Fisher | HC10001GL | |
| 95% ethanol | Fisher | HC11001GL | |
| Analysis software | Akoya Biosciences | CLS135783 | inForm version 2.3.0 |
| Antifade mountant | ThermoFisher | P36961 | ProLong Diamond |
| Blocking solution | Vector | SP-6000 | Bloxall |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Life Sciences | A9647-100G | |
| Cover Slips | Fisher | 12-548-5E | |
| Delicate task wipe | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Fluorescent diluent | Akoya Biosciences | ARD1A01EA | Opal TSA diluent |
| Fluorophore 520 | Akoya Biosciences | FP1487001KT | 1:100 |
| Fluorophore 540 | Akoya Biosciences | FP1494001KT | 1:100 |
| Fluorophore 570 | Akoya Biosciences | FP1488001KT | 1:100 |
| Fluorophore 620 | Akoya Biosciences | FP1495001KT | 1:100 |
| Fluorophore 650 | Akoya Biosciences | FP1496001KT | 1:100 |
| Fluorophore 690 | Akoya Biosciences | FP1497001KT | 1:100 |
| Fluorophore DAPI | Akoya Biosciences | FP1490 | 3 drops in TBST or PBS |
| Heat resistant box | Tissue-Tek | 25608-904 | Plastic slide box-green |
| Humidified Chamber | Ibi Scientific | AT-12 | |
| Hybridization oven | FisherBiotech | ||
| Hydrophobic barrier pen | Vector | H-4000 | ImmEdge |
| Microscope | Perkin Elmer | CLS140089 | Mantra quantitative pathology workstation |
| Microwave | Panasonic | NN-A661S | with inverter technology |
| Neutral buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | 10% neutral buffered formalin |
| pH 6 antigen retrieval buffer | Akoya Biosciences | AR600 | AR6 |
| pH 9 antigen retrieval buffer | Akoya Biosciences | AR900 | AR9 |
| Phosphate buffered saline | Fisher | BP3994 | PBS |
| Plastic slide box | Tissue-Tek | 25608-906 | |
| Plastic wrap | Fisher | NC9070936 | |
| Polysorbate 20 | Fisher | BP337-800 | Tween 20 |
| Primary antibody CD163 | Lecia | NCL-LCD163 | 1:400 |
| Primary antibody CD3 | Dako | A0452 | 1:400 |
| Primary antibody CD8 | Spring Bio | M5390 | 1:400 |
| Primary antibody FOXP3 | Dako | M3515 | 1:400 |
| Primary antibody pancytokeratin | Cell Signaling | 12653 | 1:500 |
| Primary antibody PD-L1 | Cell Signaling | 13684 | 1:200 |
| Secondary antibody | Akoya Biosciences | ARH1001EA | Opal polymer |
| Slide stain set | Electron Microscopy Sciences | 6254001 | |
| Tris buffered saline | Corning | 46-012-CM | TBS |
| Vertical slide rack | Electron Microscopy Sciences | 50-294-72 | |
| Xylene | Fisher | X3P1GAL |
References
- Lazarus, J., et al. Spatial and phenotypic immune profiling of metastatic colon cancer. JCI Insight. 3 (22), (2018).
- Barua, S., et al. A Functional Spatial Analysis Platform for Discovery of Immunological Interactions Predictive of Low-Grade to High-Grade Transition of Pancreatic Intraductal Papillary Mucinous Neoplasms. Cancer Informatics. 17, 1176935118782880 (2018).
- Yang, L., Liu, Z., Tan, J., Dong, H., Zhang, X. Multispectral imaging reveals hyper active TGF-beta signaling in colorectal cancer. Cancer Biology & Therapy. 19 (2), 105-112 (2018).
- Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nature Communications. 8, 15095 (2017).
- Steele, K. E., Brown, C. Multiplex Immunohistochemistry for Image Analysis of Tertiary Lymphoid Structures in Cancer. Methods In Molecular Biology. 1845, 87-98 (2018).
- Gorris, M. A. J., et al. Eight-Color Multiplex Immunohistochemistry for Simultaneous Detection of Multiple Immune Checkpoint Molecules within the Tumor Microenvironment. The Journal Of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7, (2017).
- Katikireddy, K. R., O’Sullivan, F. Immunohistochemical and immunofluorescence procedures for protein analysis. Methods In Molecular Biology. 784, 155-167 (2011).
- Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: basic principles and applications. Critical Reviews In Biotechnology. 37 (2), 163-176 (2017).
- Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Review of Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Zhang, W., et al. Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies. Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).
- Phenoptics Research Solutions. . Perkin Elmer Manual. , 32 (2016).
- . . Opal Multiplex IHC Assay Development Guide. , (2014).
- Carey, C. D., et al. Topological analysis reveals a PD-L1-associated microenvironmental niche for Reed-Sternberg cells in Hodgkin lymphoma. Blood. 130 (22), 2420-2430 (2017).
