अनुकूलन, डिजाइन और मैनुअल मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री में नुकसान से बचने
Summary
मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री एक उभरती हुई तकनीक है जो बरकरार फॉर्मेलिन-फिक्स्ड, पैराफिन एम्बेडेड (FFPE) ऊतक के भीतर कई सेल प्रकार के दृश्य को सक्षम बनाता है। प्रस्तुत एंटीबॉडी और अभिकर्मकों के अनुकूलन के लिए निर्देश के साथ एक सफल 7 रंग मल्टीप्लेक्स सुनिश्चित करने के लिए दिशानिर्देश हैं, स्लाइड, डिजाइन और आम समस्याओं से बचने के लिए सुझाव तैयार.
Abstract
कोशिका घुसपैठ और स्थानिक संगठन के विश्लेषण के लिए बरकरार ऊतक का सूक्ष्म पर्यावरण मूल्यांकन रोग प्रक्रियाओं की जटिलता को समझने के लिए आवश्यक है। अतीत में इस्तेमाल सिद्धांत तकनीक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) और इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) शामिल हैं जो 1 और 4 मार्करके बीच का उपयोग करके समय में स्नैपशॉट के रूप में कोशिकाओं के दृश्य को सक्षम करते हैं। दोनों तकनीकों खराब antigenic लक्ष्य और पार प्रजातियों प्रतिक्रिया से संबंधित सीमाओं धुंधला कठिनाई सहित कमियों है. IHC विश्वसनीय और reproduible है, लेकिन रसायन विज्ञान और दृश्य प्रकाश स्पेक्ट्रम पर निर्भरता की प्रकृति केवल कुछ मार्करों के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए अनुमति देता है और सह स्थानीयकरण चुनौतीपूर्ण बनाता है. IF का उपयोग संभावित मार्करों को व्यापक करता है लेकिन आम तौर पर औपचारिक निर्धारण के बाद व्यापक ऊतक autofluorscence के कारण जमे हुए ऊतक पर निर्भर करता है. फ्लो साइटोमेट्री, एक तकनीक है कि कई epitopes के एक साथ लेबलिंग सक्षम बनाता है, आईएफ और IHC की कमियों के कई abrogates, तथापि, एक एकल सेल निलंबन के रूप में कोशिकाओं की जांच करने की आवश्यकता महत्वपूर्ण जीवविज्ञान discarding कोशिकाओं के स्थानिक संदर्भ खो देता है संबंध. मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (mfIHC) समग्र microenvironment वास्तुकला और स्थानिक संरक्षण करते हुए औपचारिक रूप से फिक्स्ड पैराफिन एम्बेडेड (FFPE) ऊतक में बहु-एपिटोप सेलुलर phenotyping के लिए अनुमति देता है इन प्रौद्योगिकियों पुल अक्षुण्ण ऊतक के भीतर कोशिकाओं का संबंध. उच्च फ्लोरोसेंट तीव्रता फ्लोरोफोर्स कि ऊतक एपिटोप के लिए सहसंयोजक बंधन माध्यमिक एंटीबॉडी द्वारा प्रजातियों विशिष्ट पार प्रतिक्रिया की चिंता के बिना प्राथमिक एंटीबॉडी के कई अनुप्रयोगों के लिए सक्षम बनाता है। हालांकि इस तकनीक के लिए रोग के अध्ययन के लिए विश्वसनीय और सटीक छवियों का उत्पादन सिद्ध किया गया है, एक उपयोगी mfIHC धुंधला रणनीति बनाने की प्रक्रिया समय लगता है और व्यापक अनुकूलन और डिजाइन के कारण सटीक हो सकता है. स्थिति में सही सेलुलर बातचीत का प्रतिनिधित्व करने वाले मजबूत चित्र बनाने के लिए और मैन्युअल विश्लेषण के लिए ऑप्टिमाइज़ेशन अवधि को कम करने के लिए, यहां प्रस्तुत स्लाइड तैयारी के लिए तरीके हैं, एंटीबॉडी का अनुकूलन, मल्टीप्लेक्स डिजाइन के साथ-साथ त्रुटियों आमतौर पर धुंधला प्रक्रिया के दौरान सामना करना पड़ा.
Introduction
एक बरकरार ट्यूमर microenvironment के दृश्य (TME) ठोस द्रोह में न केवल सेलुलर घुसपैठ का मूल्यांकन करने में आवश्यक है, लेकिन सेल के रूप में अच्छी तरह से सेल बातचीत करने के लिए. मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (mfIHC) कैंसर और जुड़े रोगों के अध्ययन में कोशिकाओं के बहु-एंटीजन फीनोटाइपिंग के लिए एक प्रभावी उपकरण के रूप में उभरा है1,2,3,4, 5,6,7. यह, बड़े डेटा सेट का विश्लेषण करने के लिए डिज़ाइन किए गए उपन्यास सॉफ्टवेयर और प्रोग्राम के संयोजन में, कोशिकाओं1,2,4के बीच जटिल अन्योन्यक्रियाओं के अवलोकन में सक्षम बनाता है। डेटा अधिग्रहण में दर सीमित कारक अक्सर विश्लेषण से पहले दाग ऊतक की गुणवत्ता है.
TME में phenotype कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया पिछले तकनीक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (IHC), इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) और प्रवाह साइटोमेट्री सभी जो महत्वपूर्ण सीमाओं मौजूद शामिल हैं। IHC formalin निश्चित पैराफिन एम्बेडेड (FFPE) ऊतक वर्गों जो deparaffinized और सबसे अक्सर एक एंटीबॉडी द्वारा दाग जा रहा से पहले rehydrated का उपयोग करता है. एक घोड़े की तरह peroxidase (एचआरपी) बाध्य माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करें और एक रासायनिक प्रतिक्रिया एक विरोधी epitope8के दृश्य की अनुमति देता है. जबकि IHC विश्वसनीय है और FFPE ऊतक जो के साथ काम करने के लिए आसान है पर प्रदर्शन किया, दृश्य प्रकाश स्पेक्ट्रम के लिए सीमाओं का मतलब है केवल एक या दो मार्करों विश्वसनीय प्रतिष्ठित और एंटीजन के colocalization काफी मुश्किल8हो सकता है. उपलब्ध मार्करों का विस्तार करने के लिए एक रास्ता है और इसलिए प्रतिजन है कि एक एकल खंड पर जांच की जा सकती है फ्लोरोसेंट जो दृश्य स्पेक्ट्रम की एक व्यापक रेंज के उपयोग के लिए अनुमति देता है को बदलने के लिए है. यदि, जमे हुए या FFPE ऊतक स्लाइड और एंटीबॉडी है कि विभिन्न फ्लोरोफोर्स के लिए संयुग्मी हैं इस्तेमाल पर स्थानांतरित कर दिया है. हालांकि यह एंटीजन की संख्या बढ़ जाती है कि जांच की जा सकती है, वहाँ कई महत्वपूर्ण सीमाएं हैं. सबसे पहले, क्योंकि प्रत्येक एंटीबॉडी आम तौर पर केवल एक फ्लोरोफोर संलग्न है, चमक अक्सर ऊतक autofluorence को दूर करने के लिए पर्याप्त मजबूत नहीं है. यह इस कारण के लिए है, सबसे IF जमे हुए ऊतक जो स्टोर करने के लिए महंगा है और के साथ काम करने के लिए मुश्किल है पर किया जाता है. फ्लोरोसेंट टैग की एक सीमित संख्या वर्णक्रमीय ओवरलैप और पार प्रजातियों प्रतिक्रिया के कारण उपयोग के लिए उपलब्ध हैं, खासकर जब गैर संयोजित एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है. फ्लो साइटोमेट्री, जिसमें एक सेल निलंबन में नए ऊतक प्रसंस्करण होते हैं और फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के साथ लेबलिंग9,10दशकों के लिए इम्यूनोफेनोटाइपिंग के लिए स्वर्ण मानक रहा है. प्रवाह साइटोमेट्री का एक लाभ प्रजातियों के लिए चिंता के बिना कई एंटीबॉडी लेबल करने की क्षमता है पार प्रतिक्रिया के रूप में सबसे संयुग्मी हैं. क्योंकि कोशिकाओं को एक मशीन और नहीं मानव आँखों द्वारा “दृश्य” कर रहे हैं, वहाँ कहीं अधिक fluorophores उपलब्ध हैं, लेकिन यह एक लागत के साथ आता है. मुआवजा मैन्युअल रूप से किया जाना चाहिए जो काफी झूठी सकारात्मक और नकारात्मक आबादी का उत्पादन परिणाम बदल सकते हैं. प्रवाह साइटोमेट्री का सबसे महत्वपूर्ण सीमा यह है कि ऊतक वास्तुकला और बाद में सभी स्थानिक जानकारी एकल कोशिकाओं के निलंबन के लिए आवश्यकता से खो जाती है।
मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (mfIHC) उपन्यास सॉफ्टवेयर के साथ संयोजन में एक स्वचालित फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर संकेत प्रवर्धन के साथ धुंधला बहु-एंटीजन ऊतक की अनुमति देकर IHC, IF और प्रवाह साइटोमेट्री के लाभों को जोड़ती है मुआवजे की आवश्यकता के बिना स्थानिक संबंधों का प्रतिधारण। FFPE ऊतक आरोप लगाया स्लाइड पर रखा गया है, जो, प्रतिजन पुनर्प्राप्ति के बाद, ब्याज के लक्ष्य प्रतिजन के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी आवेदन का एक दौर से गुजरना एक एचआरपी रासायनिक टैग के साथ एक माध्यमिक एंटीबॉडी द्वारा पीछा किया, IHC के समान. द्वितीयक एंटीबॉडी की नियुक्ति के बाद, एचआरपी विशिष्ट प्रतिक्रिया के परिणामस्वरूप फ्लोरोफोर सहसंयोजक रूप से ब्याज11के प्रतीक के लिए बाध्यकारी होता है। एक बार ऊतक लेबल है, स्लाइड हीटिंग का एक और दौर पहले से लागू प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी परिसर को हटाने पूरा हो गया है केवल फ्लोरोसेंट टैग ऊतक epitope11के लिए बाध्य छोड़ने. यह किसी भी प्रजाति के कई एंटीबॉडी के लिए पार प्रतिक्रिया11,12के लिए चिंता के बिना फिर से लागू करने के लिए अनुमति देता है. एकाधिक फ्लोरोसेंट रंगों के मैनुअल मुआवजे के लिए किसी भी जरूरत को कम करने के लिए, एक परमाणु काउंटर दाग सहित थोड़ा वर्णक्रमीय ओवरलैप के साथ फ्लोरोफोर का एक संग्रह mfIHC को पूरा करने के लिए प्रयोग किया जाता है. FFPE ऊतक के साथ सामना करना पड़ा autofluorscence के लिए खाते में, सॉफ्टवेयर एक खाली स्लाइड जो फ्लोरोफोर के बाद प्रतिजन विशिष्ट फ्लोरोसेंट की ताकत की वजह से संभव है से एक छवि का उपयोग कर अंतिम छवि से autofluorscence subtracts संकेत प्रवर्धन. बड़े डेटा सेट के लिए डिज़ाइन किए गए उपन्यास कार्यक्रमों का उपयोग करते हुए सेल स्थानों की पहचान की जा सकती है और स्थानिक संदर्भ1,2,4के लिए उनका विश्लेषण किया जा सकता है। इस तकनीक का सबसे महत्वपूर्ण सीमा अनुकूलन समय है. प्रयोगात्मक डिजाइन और धुंधला और इमेजिंग रणनीति के लिए निर्देशों के साथ एक विस्तृत पद्धति यहाँ पाया जाता है. mfIHC प्रयोगशालाओं है कि वर्तमान में एक अनुकूलित स्वचालित धुंधला प्रणाली है कि बेहतर मैनुअल तकनीक का उपयोग कर बरकरार FFPE ऊतक में सेल से सेल बातचीत के स्थानिक संदर्भ को समझने के लिए करना चाहते हैं नहीं है के लिए उपयोगी हो जाएगा.
Protocol
Representative Results
Discussion
ठोस ट्यूमर बायोप्सी और सर्जिकल लकीर से बरकरार ऊतक नमूनों रोग विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण नैदानिक और भविष्य कहनेवाला उपकरण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से रोगी रोग का निदान रहते हैं. मल्टीप्लेक्स फ्ल…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों एड स्टैक शुक्रिया अदा करना चाहते हैं, पहले पर्किन Elmer से, सेटअप और मूल मल्टीप्लेक्स धुंधला के अनुकूलन के साथ उनकी सहायता के लिए. लेखकों को भी विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर सुझावों के लिए Akoya Biosciences से क्रिस्टन श्मिट शुक्रिया अदा करना चाहते हैं. इस प्रकाशन में रिपोर्ट अनुसंधान पुरस्कार संख्या P30CA046592 के तहत स्वास्थ्य के राष्ट्रीय कैंसर संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया था, K08CA201581 (tlf), K08CA234222 (जेएस), R01CA15158807 (mpm), RSG1417301CSM (mpm), R01CA19807403 (mpm), U01CA22414501 (mpm, hc), CA170568 (एच.सी.) सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करता है. अतिरिक्त सहायता जेफरी ए कोल्बी बृहदान्त्र कैंसर और टॉम लियू मेमोरियल रिसर्च फंड द्वारा प्रदान की गई थी।
Materials
| 100% ethanol | Fisher | HC8001GAL | |
| 70% ethanol | Fisher | HC10001GL | |
| 95% ethanol | Fisher | HC11001GL | |
| Analysis software | Akoya Biosciences | CLS135783 | inForm version 2.3.0 |
| Antifade mountant | ThermoFisher | P36961 | ProLong Diamond |
| Blocking solution | Vector | SP-6000 | Bloxall |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Life Sciences | A9647-100G | |
| Cover Slips | Fisher | 12-548-5E | |
| Delicate task wipe | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Fluorescent diluent | Akoya Biosciences | ARD1A01EA | Opal TSA diluent |
| Fluorophore 520 | Akoya Biosciences | FP1487001KT | 1:100 |
| Fluorophore 540 | Akoya Biosciences | FP1494001KT | 1:100 |
| Fluorophore 570 | Akoya Biosciences | FP1488001KT | 1:100 |
| Fluorophore 620 | Akoya Biosciences | FP1495001KT | 1:100 |
| Fluorophore 650 | Akoya Biosciences | FP1496001KT | 1:100 |
| Fluorophore 690 | Akoya Biosciences | FP1497001KT | 1:100 |
| Fluorophore DAPI | Akoya Biosciences | FP1490 | 3 drops in TBST or PBS |
| Heat resistant box | Tissue-Tek | 25608-904 | Plastic slide box-green |
| Humidified Chamber | Ibi Scientific | AT-12 | |
| Hybridization oven | FisherBiotech | ||
| Hydrophobic barrier pen | Vector | H-4000 | ImmEdge |
| Microscope | Perkin Elmer | CLS140089 | Mantra quantitative pathology workstation |
| Microwave | Panasonic | NN-A661S | with inverter technology |
| Neutral buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | 10% neutral buffered formalin |
| pH 6 antigen retrieval buffer | Akoya Biosciences | AR600 | AR6 |
| pH 9 antigen retrieval buffer | Akoya Biosciences | AR900 | AR9 |
| Phosphate buffered saline | Fisher | BP3994 | PBS |
| Plastic slide box | Tissue-Tek | 25608-906 | |
| Plastic wrap | Fisher | NC9070936 | |
| Polysorbate 20 | Fisher | BP337-800 | Tween 20 |
| Primary antibody CD163 | Lecia | NCL-LCD163 | 1:400 |
| Primary antibody CD3 | Dako | A0452 | 1:400 |
| Primary antibody CD8 | Spring Bio | M5390 | 1:400 |
| Primary antibody FOXP3 | Dako | M3515 | 1:400 |
| Primary antibody pancytokeratin | Cell Signaling | 12653 | 1:500 |
| Primary antibody PD-L1 | Cell Signaling | 13684 | 1:200 |
| Secondary antibody | Akoya Biosciences | ARH1001EA | Opal polymer |
| Slide stain set | Electron Microscopy Sciences | 6254001 | |
| Tris buffered saline | Corning | 46-012-CM | TBS |
| Vertical slide rack | Electron Microscopy Sciences | 50-294-72 | |
| Xylene | Fisher | X3P1GAL |
References
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