Manuel Multiplex floresan Immünhistokimya 'da optimizasyon, tasarım ve kaçınarak tuzaklar
Summary
Multiplex floresan immünhistokimya, bozulmamış formalin-sabit, parafin katıştırılmış (FFPE) dokusu içinde birden fazla hücre türlerinin görselleştirilmesini sağlayan gelişmekte olan bir teknolojidir. Sunulan başarılı bir 7-renk Multiplex antikor ve reaktifler optimize etmek için talimatlar, slaytlar, tasarım ve ortak sorunları önlemek için ipuçları hazırlanması sağlamak için yönergeler vardır.
Abstract
Hücre infiltrasyonu ve mekansal organizasyon analizi için bozulmamış doku mikroçevre değerlendirilmesi hastalık süreçlerinin karmaşıklığını anlamakta esastır. Geçmişte kullanılan prensip teknikleri, 1 ile 4 işaretçileri arasında zaman içinde bir anlık görüntü olarak hücrelerin görselleştirilmesini sağlayan immünhistokimya (ıHC) ve immünofluoresesans (IF) içerir. Her iki teknik de kötü antijenik hedefler ve çapraz türler reaktivite ile ilgili sınırlamalar boyama zorluk dahil eksiklikleri var. IHC güvenilir ve reproducible, ancak kimyasal ve görünür ışık spektrumuna güven doğası sadece birkaç işaretçileri kullanılmak üzere sağlar ve Co-yerelleştirme zorlu yapar. If kullanımı potansiyel işaretçileri genişletir, ancak genellikle formalin fikreasyon aşağıdaki geniş doku otofloresans nedeniyle dondurulmuş doku dayanır. Akış cytometri, birden fazla epiton eşzamanlı etiketleme sağlayan bir teknik, IF ve IFC eksiklikleri birçok CPAP, ancak, tek bir hücre süspansiyon olarak hücreleri incelemek için ihtiyaç önemli biyolojik atarak hücrelerin uzamsal bağlamı kaybeder Ilişki. Multiplex floresan immünhistokimya (mfihc) Bu teknolojiler, genel mikroçevre mimarisi ve mekansal koruyarak formalin sabit parafin gömülü (ffpe) doku Multi-epitope hücresel fenotiplemeyi için izin köprüler bozulmamış doku içinde hücrelerin ilişkisi. Yüksek floresan yoğunluğu fluorophores bu kovalently doku epitopu bağ türü belirli çapraz reaktivite ikincil antikorlar endişe etmeden primer antikorların birden fazla uygulama sağlar. Bu teknoloji hastalığın çalışması için güvenilir ve doğru görüntüler üretmek için kanıtlanmış olmasına rağmen, yararlı bir mfIHC boyama stratejisi oluşturma süreci zaman alıcı ve kapsamlı optimizasyon ve tasarım nedeniyle titiz olabilir. Doğru hücresel etkileşimleri temsil eden ve manuel analiz için optimizasyon süresini azaltmak için sağlam görüntüler yapmak amacıyla, burada sunulan slayt hazırlama, antikorlar, Multiplex tasarım yanı sıra hataları optimize etmek için Yöntemler genellikle boyama işlemi sırasında karşılaşılan.
Introduction
Bozulmamış bir tümör mikroortamının (TME) görselleştirilmesi, sadece katı malignitelerde hücresel infiltrasyonu değil, hücrenin hücre etkileşimlerini de değerlendirmede esastır. Multiplex floresan immünhistokimya (mfihc) kanser ve ilişkili hastalıklar çalışmada hücrelerin Multi-antijen fenotiplemeyi için etkili bir araç olarak ortaya çıkmıştır1,2,3,4, 5,6,7. Bu, büyük veri setleri analiz etmek için tasarlanmış yeni yazılım ve programlar ile birlikte, hücreler1,2,4arasındaki karmaşık etkileşimlerin gözlem sağlar. Veri toplama faktörü sınırlama oranı genellikle analiz öncesinde lekeli doku kalitesidir.
TME ‘deki fenotip hücrelerinde kullanılan önceki teknikler arasında immunohistokimya (IHC), immünofluoresesans (IF) ve akış sitometri bulunmaktadır ve bu da önemli sınırlamalar sunar. IHC, en sık bir antikor tarafından lekelenmeden önce deparafsonize edilmiş ve rehydrated olan formalin sabit parafin gömülü (FFPE) doku bölümlerini kullanır. Bir horserpu peroksidaz (HRP) bağlı ikincil antikor ve kimyasal reaksiyon kullanımı tek bir antijenik epitopu görselleştirme sağlar8. IHC güvenilir ve birlikte çalışması kolay FFPE doku üzerinde gerçekleştirilen, görünür ışık spektrumuna sınırlamalar sadece bir veya iki işaretçileri güvenilir seçkin ve antijenlerin kolokalizasyonu oldukça zor8anlamına gelir. Kullanılabilir işaretçileri genişletmek için bir yol ve bu nedenle tek bir bölümde probed edilebilir antijenler görsel spektrumunun daha geniş bir yelpazede kullanımı için izin floresans değiştirmek için. Eğer, dondurulmuş veya FFPE doku slaytlar üzerine transfer edilir ve çeşitli fluorophores konjuyum kullanılan antikorlar. Bu probed edilebilir antijenler sayısını artırır iken, birkaç önemli sınırlamalar vardır. İlk olarak, her antikor genellikle sadece bir fluorophore bağlı olduğundan, parlaklık genellikle doku autofluorescence aşmak için yeterince güçlü değildir. Bu nedenle, çoğu If saklamak için pahalı ve çalışmak zor dondurulmuş doku üzerinde gerçekleştirilir. Floresan etiketleri sınırlı sayıda spektral örtüşme ve çapraz türler reaktivite özellikle olmayan konjued antikorlar kullanıldığında nedeniyle kullanım için kullanılabilir. Tek hücreli süspansiyon içine taze doku işleme ve floresan antikorlar ile etiketleme oluşan akış sitometri, onlarca yıldır immünofenotipleme için altın standart olmuştur9,10. Akış cytometri bir yararı türleri çapraz reaktivite için endişe olmadan çoklu antikorlar etiket yeteneği en konjut olduğu gibi. Hücreler bir makine ve insan gözleri değil “görselleştirilen” Çünkü, çok daha fazla fluorophores mevcuttur ama bu bir maliyet ile birlikte gelir. Tazminat, yanlış pozitif ve negatif nüfus üreten sonuçları önemli ölçüde değiştirebilir el ile yapılmalıdır. Akış sitometri en önemli sınırlama, doku mimarisi ve daha sonra tüm uzamsal bilgiler tek hücreler süspansiyon gereksinimi ile kaybolur.
Yeni yazılım ile birlikte otomatik bir floresan mikroskop kullanan Multiplex floresan immünhistokimya (mfIHC), ıFC, IF ve akış sitometri avantajlarını, sinyal amplifikasyonu ile çok antijen doku boyama ve tazminat gerek kalmadan uzamsal ilişkilerin saklanması. FFPE doku şarj slaytlar üzerine yerleştirilir, antijen alımı sonra, ıFC benzer bir HRP kimyasal etiketi ile ikincil bir antikor takip faiz hedef antijen birincil antikor uygulama bir yuvarlak geçmesi. İkincil antikor yerleştirdikten sonra, bir HRP spesifik reaksiyon bir fluorophore rastlamak ilgi epitopu için bağlayıcı bir sonuç11. Doku etiketlendikten sonra, slaytlar Isıtma başka bir turda sadece floresan etiketi doku epitopu bağlı bırakarak önceden uygulanan birincil ve ikincil antikor kompleksi kaldırma tamamlandı11. Bu, herhangi bir türün birden fazla antikorlarının Cross-reactivity11,12için endişe olmadan yeniden uygulanması için izin verir. Çoklu floresan boyalar manuel telafisi için herhangi bir ihtiyacı en aza indirmek için, bir nükleer sayaç leke dahil olmak üzere küçük spektral örtüşme ile fluorophores bir koleksiyon mfIHC tamamlamak için kullanılır. Ffpe doku ile karşılaşılan otofloresans dikkate almak için, yazılım, florophore aşağıdaki antijen spesifik floresans gücü nedeniyle mümkün olan boş bir slayttan bir görüntü kullanarak son görüntüden otofloresans çıkarır sinyal amplifikasyon. Büyük veri kümeleri için tasarlanmış yeni programları kullanarak, hücre konumları tespit ve uzamsal bağlam1,2,4için analiz edilebilir. Bu tekniğin en önemli sınırlaması optimizasyon zamanidir. Deneysel tasarım ve boyama ve görüntüleme stratejisi talimatlarını içeren ayrıntılı bir metodoloji burada bulunur. mfIHC Şu anda manuel tekniği kullanarak bozulmamış FFPE doku hücre-hücre etkileşimlerin uzamsal bağlamı daha iyi anlamak istiyorum optimize edilmiş otomatik boyama sistemi yok laboratuvarlar için yararlı olacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Katı tümör biyopsisi ve cerrahi rezeksiyondan gelen bozulmamış doku örnekleri, hasta prognoz yanı sıra hastalık analizi için önemli tanı ve öngörü araçları olarak kalır. Multiplex floresan immünhistokimya (mfIHC), immünhistokimya (ıHC), immünofluoresesans (IF) ve akış sitometri avantajlarını birleştiren yeni bir tekniktir. Bir doku ortamında hücre-hücre düzenlemeleri değerlendirilmesi için izin var situ hücre prob önceki yöntemleri8, ancak, probed olabilir epite…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Perkin Elmer daha önce Ed Stack teşekkür etmek istiyorum, kurulum ve orijinal Multiplex boyama optimizasyonu ile onun yardımı için. Yazarlar da analiz yazılımı kullanarak ipuçları için Akoya Biosciences gelen Kristen Schmidt teşekkür etmek istiyorum. Bu yayında bildirilen araştırma, Ulusal Kanser Sağlık Enstitüleri tarafından ödül numarası P30CA046592, K08CA201581 (TLF), K08CA234222 (js), R01CA15158807 (MPM), RSG1417301CSM (MPM), R01CA19807403 (MPM), U01CA22414501 (MPM, HC) altında desteklenmektedir. CA170568 (HC). İçerik sadece yazarlar sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmez. Ek destek Jeffery A. Colby Colon Cancer ve Tom Liu Memorial araştırma fonları tarafından sağlandı.
Materials
| 100% ethanol | Fisher | HC8001GAL | |
| 70% ethanol | Fisher | HC10001GL | |
| 95% ethanol | Fisher | HC11001GL | |
| Analysis software | Akoya Biosciences | CLS135783 | inForm version 2.3.0 |
| Antifade mountant | ThermoFisher | P36961 | ProLong Diamond |
| Blocking solution | Vector | SP-6000 | Bloxall |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Life Sciences | A9647-100G | |
| Cover Slips | Fisher | 12-548-5E | |
| Delicate task wipe | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Fluorescent diluent | Akoya Biosciences | ARD1A01EA | Opal TSA diluent |
| Fluorophore 520 | Akoya Biosciences | FP1487001KT | 1:100 |
| Fluorophore 540 | Akoya Biosciences | FP1494001KT | 1:100 |
| Fluorophore 570 | Akoya Biosciences | FP1488001KT | 1:100 |
| Fluorophore 620 | Akoya Biosciences | FP1495001KT | 1:100 |
| Fluorophore 650 | Akoya Biosciences | FP1496001KT | 1:100 |
| Fluorophore 690 | Akoya Biosciences | FP1497001KT | 1:100 |
| Fluorophore DAPI | Akoya Biosciences | FP1490 | 3 drops in TBST or PBS |
| Heat resistant box | Tissue-Tek | 25608-904 | Plastic slide box-green |
| Humidified Chamber | Ibi Scientific | AT-12 | |
| Hybridization oven | FisherBiotech | ||
| Hydrophobic barrier pen | Vector | H-4000 | ImmEdge |
| Microscope | Perkin Elmer | CLS140089 | Mantra quantitative pathology workstation |
| Microwave | Panasonic | NN-A661S | with inverter technology |
| Neutral buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | 10% neutral buffered formalin |
| pH 6 antigen retrieval buffer | Akoya Biosciences | AR600 | AR6 |
| pH 9 antigen retrieval buffer | Akoya Biosciences | AR900 | AR9 |
| Phosphate buffered saline | Fisher | BP3994 | PBS |
| Plastic slide box | Tissue-Tek | 25608-906 | |
| Plastic wrap | Fisher | NC9070936 | |
| Polysorbate 20 | Fisher | BP337-800 | Tween 20 |
| Primary antibody CD163 | Lecia | NCL-LCD163 | 1:400 |
| Primary antibody CD3 | Dako | A0452 | 1:400 |
| Primary antibody CD8 | Spring Bio | M5390 | 1:400 |
| Primary antibody FOXP3 | Dako | M3515 | 1:400 |
| Primary antibody pancytokeratin | Cell Signaling | 12653 | 1:500 |
| Primary antibody PD-L1 | Cell Signaling | 13684 | 1:200 |
| Secondary antibody | Akoya Biosciences | ARH1001EA | Opal polymer |
| Slide stain set | Electron Microscopy Sciences | 6254001 | |
| Tris buffered saline | Corning | 46-012-CM | TBS |
| Vertical slide rack | Electron Microscopy Sciences | 50-294-72 | |
| Xylene | Fisher | X3P1GAL |
References
- Lazarus, J., et al. Spatial and phenotypic immune profiling of metastatic colon cancer. JCI Insight. 3 (22), (2018).
- Barua, S., et al. A Functional Spatial Analysis Platform for Discovery of Immunological Interactions Predictive of Low-Grade to High-Grade Transition of Pancreatic Intraductal Papillary Mucinous Neoplasms. Cancer Informatics. 17, 1176935118782880 (2018).
- Yang, L., Liu, Z., Tan, J., Dong, H., Zhang, X. Multispectral imaging reveals hyper active TGF-beta signaling in colorectal cancer. Cancer Biology & Therapy. 19 (2), 105-112 (2018).
- Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nature Communications. 8, 15095 (2017).
- Steele, K. E., Brown, C. Multiplex Immunohistochemistry for Image Analysis of Tertiary Lymphoid Structures in Cancer. Methods In Molecular Biology. 1845, 87-98 (2018).
- Gorris, M. A. J., et al. Eight-Color Multiplex Immunohistochemistry for Simultaneous Detection of Multiple Immune Checkpoint Molecules within the Tumor Microenvironment. The Journal Of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7, (2017).
- Katikireddy, K. R., O’Sullivan, F. Immunohistochemical and immunofluorescence procedures for protein analysis. Methods In Molecular Biology. 784, 155-167 (2011).
- Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: basic principles and applications. Critical Reviews In Biotechnology. 37 (2), 163-176 (2017).
- Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Review of Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Zhang, W., et al. Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies. Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).
- Phenoptics Research Solutions. . Perkin Elmer Manual. , 32 (2016).
- . . Opal Multiplex IHC Assay Development Guide. , (2014).
- Carey, C. D., et al. Topological analysis reveals a PD-L1-associated microenvironmental niche for Reed-Sternberg cells in Hodgkin lymphoma. Blood. 130 (22), 2420-2430 (2017).
