Summary

Arabidopsis Çift Döllenmede Sperm Nükleer Morfolojisinin İzlenmesi ile Döllenme Durumunun Değerlendirilmesi

Published: August 29, 2019
doi:

Summary

Arabidopsis çift döllenmede sperm nükleer morfolojisi temelinde epifloresan mikroskobu kullanılarak başarılı veya başarısız döllenmeyi belirlemek için bir yöntem gösterilmektedir.

Abstract

Çiçekli bitkilerin benzersiz bir cinsel üreme sistemi ‘çift döllenme’ olarak adlandırılan, hangi sperm hücrelerinin her tam bir yumurta hücresi veya merkezi bir hücre ile kaynaşır. Böylece, iki bağımsız döllenme olayları hemen hemen aynı anda gerçekleşir. Döllenmiş yumurta hücresi ve merkezi hücre sırasıyla zigot ve endosperm haline gelişir. Bu nedenle, çift gübreleme nin kesin kontrolü takip eden tohum gelişimi için gereklidir. Çift döllenme kadın gametophyte oluşur (embriyo kesesi), derin gizli ve kalın ovule ve yumurtalık dokuları ile kaplı. Bu pistil doku yapısı, çift döllenmenin gözlem ve analizini oldukça zorlaştırmış ve çift gübreleme mekanizmasıile ilgili birçok sorunun cevapsız kaldığı mevcut durumu yaratmıştır. Döllenme düzenleyicisi için potansiyel bir adayın fonksiyonel değerlendirilmesi için döllenmenin henotibik analizi önemlidir. Arabidopsis thalianadöllenmenin tamamlanmasını yargılamak için, sperm çekirdeklerini etiketleyen floresan sinyallerinin şekilleri gösterge olarak kullanılır. Döllenmeyi başaramayan bir sperm hücresi dişi gametlerin dışında yoğunlaştırılmış floresan sinyali ile gösterilirken, başarılı bir şekilde döllenen bir sperm hücresi, dişi gametlerin çekirdeğiile karyogami nedeniyle yoğunlaştırılmış bir sinyalle gösterilir. Burada açıklanan yöntem in vivo koşullar altında başarılı veya başarısız döllenme belirlemek için bir araç sağlar.

Introduction

Çiçekli bitkiler çift gübreleme yoluyla tohum üretmek, doğrudan gamet plazma membran lokalize proteinler arasındaki etkileşimler tarafından kontrol edilen bir süreç1,2. Çiçekli bitki erkek gametler, sperm hücrelerinin bir çift, polen gelişir. Tozlaşma dan sonra büyüyen bir polen tüpü kadın gametler, bir yumurta hücresi ve bir embriyo kesesinde geliştirmek merkezi bir hücre, sperm hücrelerinin bir çift sunar. Erkek ve dişi gametler karşılaştıktan sonra, gamet yüzeyindeki proteinler çift döllenmeyi tamamlamak için tanıma, bağlanma ve füzyonu teşvik eder. Daha önceki çalışmalarda erkek gamet membran proteinleri GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 (GCS1)/HAPLESS2 (HAP2)3,4 ve GAMETE EXPRESSED 2 (GEX2)5 gamet füzyonu ile ilgili döllenme düzenleyicileri olarak tanımlanmış ve sırasıyla ek. Yakın zamanda bir erkek gamet özgü membran proteini, DUF679 DOMAIN MEMBRAN PROTEIN 9 (DMP9), gamet etkileşimi dahil bir döllenme regülatörü olarak tespit. DMP9 ekspresyonundaki azalmanın A. thaliana6’da çift döllenme sırasında yumurta hücresi döllenmesinin önemli ölçüde inhibisyonuna yol açabilen bir azalma olduğunu bulduk.

Çift döllenme yumurtalık dokusu ile daha fazla sarılmış bir ovule gömülü bir embriyo kese, oluşur gibi, gözlemlemek ve çift döllenme süreçlerinin durumları analiz etmek zordur. Bu nedenle, çift döllenme kontrolü tüm mekanizmasının tam bir anlayış engelleyen birçok belirsiz noktaları hala vardır. İn vivo koşullarda çift döllenme sırasında gametlerin davranışlarını takip etmek için gözlem tekniklerinin oluşturulması, döllenme düzenleyicileri için potansiyel adayların fonksiyonel analizi için vazgeçilmezdir. Son çalışmalarda gamet alt hücreli yapıların floresan proteinlerile etiketlendiği marker çizgileri ortaya çıkar. Bu makalede, yapay tozlaşma pistillerden elde edilen bir embriyo kesesinde meydana gelen çift döllenmeyi gözlemlemek için basit ve hızlı bir protokol göstermiş bulunuyoruz. Sperm hücresi çekirdek marker hattı HTR10-mRFP7kullanılarak, her dişi gametin döllenme durumu sperm nükleer sinyal morfolojisi temelinde ayrımcılığa uğrayabilir. Döllenmede sperm çekirdeklerinin bu kadar morfolojik değişimine odaklanan protokolümüz, istatistiksel kanıt için yeterli miktarda veri elde edebilir. Tek bir döllenme paterni göstermek için erkek bitki olarak HTR10-mRFP arka planlı(DMP9KD/HTR10-mRFP)dmp9-knockdown hattı kullanılmıştır. Protokol aynı zamanda diğer gübreleme regülatörlerinin fonksiyonel analizi için de uygundur.

Protocol

1. Yapay Tozlaşma NOT: İşleme başlamadan önce, 5 numaralı forceps bir çift gereklidir. A. thaliana (Col-0) 22 °C’de 16-h ışık/8-h karanlık bir döngü altında bir büyüme odasında büyüyün.NOT: Kes ve aksiller tomurcukları gelişimini teşvik etmek makas ile ilk geliştirilen çiçek sapı kaldırın. Şiddetle büyüyen bitkiler (ilk sap kestikten 2-3 hafta sonra; bitki yüksekliği yaklaşık 25 cm) analiz için uygun…

Representative Results

DMP9KD/HTR10-mRFP ile tozlanmış bir pistil ovules 7-8 HAP toplandı ve gözlendi. Ovulların çoğunda yumurta hücresi (mikropylar yan) ve merkezi hücre (charazal end side) çekirdek pozisyonlarında sırasıyla (Şekil3A)iki adet yoğuşmalı mRFP etiketli sperm çekirdeği bulunurve bu da başarılı çift döllenmeyi gösterir. Buna ek olarak, merkezi hücre çekirdeğind…

Discussion

HTR10-mRFP etiketleri baba kromatin (yani, sperm hücre çekirdekleri görselleştirir), ve çift döllenme dinamikleri bildirilmiştir7. Polen tüpünden salındıktan hemen sonra HTR10-mRFP etiketli sperm çekirdekleri hala yoğunlaşır. Ancak, sperm çekirdeklerinin her biri gamet membran füzyon7sonra karyogamy üç ila dört saat bir döllenmiş kadın gamet çekirdeği ile birleştirme üzerine decondensed . Döllenmemiş sperm hücreleri yoğun kalır, hangi gcs…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Japonya Bilim KAKENHI hibe (JP17H05832 T. I.) teşvik için Japonya Derneği tarafından desteklenen ve Phytochemical Bitki Moleküler Bilimler Stratejik Öncelik Araştırma Tanıtım Programı fon tarafından, Chiba Üniversitesi (Japonya).

Materials

BX51 Olympus Epifluorescence microscope
Cover glass Matsunami glass C018181
DMP9KD/HTR10-mRFP Arabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background
Takahashi et al. (2018)6
Double-sided tape Nichiban NW-15S 15 mm width
DP72 Olympus Degital camera
Forceps Vigor Any No. 5 forceps are available
Growth chamber Nihonika LPH-411PFQDT-SP
HTR10-mRFP Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 (Col-0) background
Ingouff et al. (2007)7
Injection needle Terumo NN-2719S 27 gauge
Slide glass Matsunami glass S9443
SZX9 Olympus Dissecting microscope
U-MRFPHQ Olympus Fluorescence Filter Cube (Excitation: BP535-555, Emission: BA570-625, Dichromatic mirror:DM565)
UPlanFL N 40x Olympus Objective lens (NA 1.3), oil-immersion
UPlanSApo 20x Olympus Objective lens (NA0.75), dry

References

  1. Mori, T., Kawai-Toyooka, H., Igawa, T., Nozaki, H. Gamete dialogs in green lineages. Molecular Plant. 8, 1442-1454 (2015).
  2. Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M. Fertilization mechanisms in flowering plants. Current Biology. 26, R125-R139 (2016).
  3. Mori, T., Kuroiwa, H., Higashiyama, T., Kuroiwa, T. GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 is essential for angiosperm fertilization. Nature Cell Biology. 1, 64-71 (2006).
  4. von Besser, K., Frank, A. C., Johnson, M. A., Preuss, D. Arabidopsis HAP2 (GCS1) is a sperm-specific gene required for pollen tube guidance and fertilization. Development. 133, 4761-4769 (2006).
  5. Mori, T., Igawa, T., Tamiya, G., Miyagishima, S. Y., Berger, F. Gamete attachment requires GEX2 for successful fertilization in Arabidopsis. Current Biology. 24, 170-175 (2014).
  6. Takahashi, T., et al. The male gamete membrane protein DMP9/DAU2 is required for double fertilization in flowering plants. Development. 145, dev170076 (2018).
  7. Ingouff, M., Hamamura, Y., Gourgues, M., Higashiyama, T., Berger, F. Distinct dynamics of HISTONE3 variants between the two fertilization products in plants. Current Biology. 17, 1032-1037 (2007).
  8. Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Early flower development in Arabidopsis. Plant Cell. 2, 755-767 (1990).
  9. Kasahara, R. D., Maruyama, D., Higashiyama, T. Fertilization recovery system is dependent on the number of pollen grains for efficient reproduction in plants. Plant Signaling & Behavior. 8, e23690 (2013).
  10. Kasahara, R. D., et al. Fertilization recovery after defective sperm cell release in Arabidopsis. Current Biology. 22, 1084-1089 (2012).
  11. Hamamura, Y., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana. Current Biology. 21, 497-502 (2011).
  12. Igawa, T., Yanagawa, Y., Miyagishima, S., Mori, T. Analysis of gamete membrane dynamics during double fertilization of Arabidopsis. Journal of Plant Research. 126, 387-394 (2013).

Play Video

Citer Cet Article
Takahashi, T., Igawa, T. Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization. J. Vis. Exp. (150), e59916, doi:10.3791/59916 (2019).

View Video