Vurdering af oxidative skader i den primære mus okulære overfladeceller / stamceller som reaktion på Ultraviolet-C (UV-C) Skader

Summary

Denne protokol viser samtidig påvisning af reaktive iltarter (ROS), levende celler og døde celler i levende primære kulturer fra museoklære overfladeceller. 2′,7′-Dichlorfluoresceindiacetate, propidiumiodid og Hoechst farvning anvendes til at vurdere henholdsvis ROS, døde celler og levende celler efterfulgt af billeddannelse og analyse.

Abstract

Okulær overflade udsættes for regelmæssig slitage på grund af forskellige miljømæssige faktorer. Udsættelse for UV-C-stråling udgør en sundhedsrisiko på arbejdspladsen. Her demonstrerer vi eksponeringen af primære stamceller fra museoklær overflade til UV-C-stråling. Reaktiv iltarter (ROS) dannelse er udlæsningen af omfanget af oxidativ stress / skade. I en eksperimentel in vitro indstilling, er det også vigtigt at vurdere procentdelen af døde celler genereret på grund af oxidativstress. I denne artikel vil vi demonstrere 2′,7′-Dichlorfluoresceindiacetate (DCFDA) farvning af UV-C eksponeret mus primære okulære overflade stamceller og deres kvantificering baseret på fluorescerende billeder af DCFDA farvning. DCFDA farvning svarer direkte til ROS generation. Vi demonstrerer også kvantificeringen af døde og levende celler ved samtidig farvning med propidiumiodid (PI) og Hoechst 3332 henholdsvis og procentdelen af DCFDA (ROS positive) og PI positive celler.

Introduction

Den okulære overflade (OS) er en funktionel enhed, der hovedsagelig består af det ydre lag og kirtelepithelia af hornhinden, lachrymal kirtel, meibomiankirtel, konjunktiva, en del af øjenlåget margener og innervations at transduce signaler¹. Den gennemsigtige kuppel formet hornhinde lag fokuserer lys på nethinden. Denne avaskulære væv er sammensat af cellulære komponenter såsom epitelceller, keratorer, og endotelceller og acellulære komponenter såsom kollagen og glycosaminoglycans². Området er drænet af tårer, der også leverer de fleste af de næringsstoffer. Den anatomiske position af OS tvinger det til at være i direkte kontakt med det ydre miljø, ofte udsætter det for forskellige barske komponenter såsom stærkt lys, mikrober, støvpartikler og kemikalier. Denne faktor prædisponerer OS til fysiske skader og gør det tilbøjelige til forskellige sygdomme.

Oxidativ stress er forårsaget på grund af uligevægt mellem produktionen af reaktive ilt arter (ROS) og endogene antioxidant forsvar mekanismer³. ROS er klassificeret i reaktive molekyler og frie radikaler, som begge er afledt af molekylær ilt (O₂₎gennem mitokondriel oxidativ fosforylering⁴. Den tidligere gruppe består af ikke-radikale arter som hydrogenperoxid (H₂O₂), singlet oxygen (¹O₂), og sidstnævnte omfatter arter som superoxidanioner (O₂^–) og hydroxylradikaler (^•OH), blandt andre. Disse molekyler er biprodukter af normale cellulære processer og deres roller har været involveret i vigtige fysiologiske funktioner såsom signal transduktion, genekspression, og vært forsvar⁵. En forbedret produktion af ROS er kendt for at blive genereret som reaktion på faktorer som patogen invasion, xenobiotika, og eksponering for ultraviolet (UV) stråling⁴. Denne overproduktion af ROS resulterer i oxidativstress, der fører til skader på molekyler som nukleinsyrer, proteiner og lipider⁶.

Naturligt sollys, den mest dominerende kilde til UV-stråling, er sammensat af UV-A (400-320 nm), UV-B (320-290 nm), og UV-C (290-200 nm)⁷. Der er rapporteret om en omvendt sammenhæng mellem bølgelængden og spektrale energier. Selv om naturlig UV-C-stråling absorberes af atmosfæren, udsender kunstige kilder såsom kviksølvlamper og svejseinstrumenter og udgør derfor en erhvervsrisiko. Symptomer på eksponering for øjne omfatter fotokeratitis og fotokeratoconjunctivitis⁸. Produktion af ROS er en af de vigtigste mekanismer til at påføre UV-induceret cellulære skader⁹. I den aktuelle undersøgelse påviser vi påvisning af ROS ved hjælp af 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFDA) farvningsmetode i de primære okulære overfladeceller/stamceller, der udsættes for UV-C. Den grønne fluorescens blev fanget ved hjælp af fluorescerende mikroskopi. Cellerne var kontrafarvede med to farvestoffer, Hoechst 33342 og rød propidiumiodid, for at plette henholdsvis levende og døde celler.

Protocol

Forsøget blev udført på primære okulære celler / stamceller stammer fra den schweiziske albino museøje. Brugen af dyr til høst af øjnene til dette eksperiment blev godkendt af Den Institutionelle Etiske Komité for Dyrs Dyr, Yenepoya (anses for at være universitet) (IEAC-godkendelsesnummer, 6a/19.10.2016). 1. Præparater af reagenser BEMÆRK: Afledning af primære celler/stamceller fra museoklær overflade ligger uden for denne protokols anvendelsesområde. D…

Representative Results

DCFDA er et farveløst farvestof, der er en kemisk reduceret form for fluorescein, der anvendes som indikator for påvisning af ROS i celler. Dette farvestof bliver fanget inde i celler og er let oxideret til fluorescerende dichlorodihydrofluorescein (DCF), som udsender en grøn fluorescens. Denne fluorescens kan påvises ved hjælp af fluorescerende mikroskopi. Cellerne kan visualiseres og korreleres med ROS-akkumulering som følger: (i) levende celler uden ROS udsender høj blå fluorescens; ii) levende celler med ROS-…

Discussion

Den DCFDA farvning metode, der er beskrevet her gør det muligt visualisering af ROS i mus primære okulære levende celler behandlet med UV-C-stråling. En fordel ved denne farvning metode er, at det også giver forskerne mulighed for at studere de umiddelbare virkninger af UV-C (3 timer efter UVC eksponering) på de levende celler og deres samtidige optælling for den procentdel af ROS positive, samt, døde celler. Da farvningsmetoden anvendes på levende celler, kan cellerne desuden inkuberes yderligere i de samme med…

Materials

2',7'-Dichlorofluorescein diacetate (DCFDA)	Sigma	D6883	2',7'-Dichlorofluorescein diacetate is fluorogenic probe and is permeable to cells. It is used for quantification of reactive oxygen species.
Cell culture dish (35 mm)	Eppendorf	SA 003700112	Sterile dishes for culturing the cells.
DMEM High Glucose	HiMedia	AT007	Most widely used cell culture media, contains 4500 mg/L of glucose.
Fetal Bovine Serum, EU Origin	HiMedia	RM99955	One of the most important components of cell culture media. It provides growth factors, amino acids, proteins, fat-soluble vitamins such as A, D, E, and K, carbohydrates, lipids, hormones, minerals, and trace elements.
GlutMax	Gibco, Thermo Fisher Scientific	35050061	Used as a supplement and an alternative to L-glutamine. It helps in improving cell viability and growth.
HL-2000 Hybrilinker	UVP		Hybridization oven/UV cross linker
Hoechst 33342	Sigma	B2261	Hoechst stain is permeable to both live and dead cells. It binds to double starnded DNA irrespective of wether the cell is dead or alive.
Matrigel	Corning		Basement membrane matrix
MEM Non-Essential Amino Acids (100X)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	11140050	Used as a supplement to increase the cell growth and viability.
Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	15140122	Penicillin and streptomycin is used to prevent the bacterial contamination in culture.
Propidium Iodide	Sigma	P4170	Fluorescent dye which is only permeable to dead cells. It binds with DNA and helps in distinguishing between live and dead cells.
TryplE Express	Thermo Fisher Scientific		Gentle cell dissociation agent
ZOE Fluorescent Cell Imager	Bio-rad