פרוטוקול זה מתאר התקנה מקורית המשלבת מדידות ספקטרליות ולאורך החיים כדי להעריך förster תהודה העברת אנרגיה (לדאוג) בין מבוססי rhodamine בבדיקות פלורסנט ליגנין פולימר ישירות בסעיפים צמח עבה.
ביומסה (LB), הפעילות של אנזימים מוגבלת על ידי מראה של אינטראקציות לא ספציפיות עם ליגנין בתהליך הידרוליזה, אשר שומר על אנזימים הרחק המצע שלהם. אפיון של אינטראקציות מורכבות אלה מהווה אתגר באמצעות מצעים מורכבים כגון LB. השיטה כאן מודדת אינטראקציות מולקולריות בין פלואור-מולקולות מתויגות ו-פלורסנט מקורית ליגניב, להתגלות על ידי העברת אנרגיה בתהודה של Förster (לדאוג). בניגוד מדידות למדוד בתאי החיים באמצעות שני fluorסוגני אקסוגניים, מדידות למדוד בצמחים באמצעות ליגנין הוא לא טריוויאלי עקב מורכבים autoפלואורסצנטית שלה. פיתחנו צינור הרכישה המקורי ניתוח עם התבוננות בקורלציה של שני מאפיינים משלימים של פלואורסצנטית: פליטת הזריחה והחיים. sFLIM (מיקרוסקופ הדמיה של תקופת החיים ספקטרלית ופלורסנט) מספק את הקוונפיקציה של אינטראקציות אלה עם רגישות גבוהה, חשיפת רמות אינטראקציה שונות בין biomolecules ו lignin.
הידרוליזינג ללינותאית לסוכרים monomeric כגון גלוקוז דורש אנזימים. הפעילות שלהם ידוע להיות מרוסן על ידי הקמתה של אינטראקציות שאינן ספציפיות בין אנזימים לבין ליגנין1,2, השני הוא פולימר הידרופובי ומהווה העיקרי של lignocellulose3. לפיכך, מדידת האינטראקציות כאלה ישירות בקנה מידה הסלולר הוא אתגר כי חייב להיות ממוען כדי למטב את פעילות האנזים קטליטי ו ליגנותאית טרום טיפול4.
Förster (או זריחה) העברת אנרגיה התהודה (לדאוג) מדידה היא שיטה של בחירה לישבנים biomolecules אינטראקציה באתרו. זה העברה אנרגיה רדיוטיבית יכול להתרחש בין תורם לבין הקבלה fluorophore אם הם ממלאים תנאים שונים. הספקטרום של פליטת התורמים חייב לחפוף, לפחות באופן חלקי, את ספקטרום העירור. הבחירה של fluorophores הוא ולכן קריטי עבור ניסויים כאלה. לאחר מכן, יעילות המעבר יורדת עם הכוח השישי של מרחק שלהם5 ורק מתרחשת אם שתי המולקולות הן בסביבה קרובה (בדרך כלל בטווח ננומטר). מגירה אחרת יכול לשנות את היעילות העברה כגון התמצאות dipole-dipole אבל הם הרבה יותר אם fluorophores יש גמישות.
לדאוג ניתן למדוד על ידי טכניקות שונות ותיאורים מפורטים ניתן למצוא בספרות6,7. בקצרה, השיטות העיקריות להסתמך על: i) הפליטה רגישות שבה הווריאציה על הפליטה לקבלה להיות מוכן ומספק תוצאות איכותיות בעיקר; ii) קבלת photobleaching לבנה שבה פליטת התורם הפלואורסצנטית נמדד לפני ואחרי קבלת הלבנת התמונות (במקרה זה, הערכות מדויקות יותר של הערכת ניתן להשיג אך דורשים כוח לייזר חזק להחיל דגימות קבועות); ו-iii) מדידה לכל החיים הפוחתת עבור התורם בנוכחות המאשר. שיטה זו מחייבת מכשירים ספציפיים ומאפשרת מדידות אינטראקציה מדויקות ורגישות בין fluorophores. בהתחשב מדידה הקשת בין הפלורסנט בדיקה ליגנותאית, הקושי העיקרי הוא כי lignocellulose הוא לא אחד היטב מאופיין fluorophore: יש לו מקורית חזקה ובעלת היקף מקורי, בעיקר שמקורם lignin, תלוי מינים ביומסה8,9.
במאמר זה, אנו מציעים הליך חדש ומקורי המותאמים למקטעים של דגימות עץ/צמחים. זו שיטה מבוססת sflim פותח את הדרך למדידות מדידה כמותית בין בדיקות פלורסנט לליגנין בדוגמאות יליד ליגנותאית.
מדידות של אורך החיים הפלואורסצנטית וספקטרום פליטה מאפשר שילוב יתרונות של שתי השיטות. ואכן, מדידות ספקטרליות חסרות רגישות בלבד ונשארות איכותיות. מצד שני, החיים הפלואורסצנטית היא שיטת הבחירה עבור מדידות מסורתיות הכמותי, אבל זה היה הוכיחה כי ליגנין autoפלואורסצנטית יכול להשתנות בהתאם ליגנין קומפוזיציה וסביבה16. לפיכך, ליגנין אינטראקציות עם קבלה או לימוד של שינויים מבניים לא יכולים להיות מפלים מאחר ששניהם גורמים לירידה בחיים. כפי שמתואר, השיטה המפותחת מספקת מדידה חד משמעית, רגישה וכמותית של אינטראקציות בין ליגנין לבין מולקולות לקבלה בסעיפים הצמח. גם אם השלבים השונים של השיטה היו ממוטבים בקפדנות, יש לנקוט זהירות במיוחד עבור הנקודות הבאות.
בנוגע לדגימות, איכות סעיף הצמח היא קריטית כדי להבטיח הדמיה בפוקוס. השלבים השונים עבור הטבעה יתד יש לעקוב בקפדנות. שלב הכביסה הסופי חיוני כדי להבטיח שאין הפרעות מ-פג הנותרים בדגימות. יתר על כן, ריכוז המאגר ו-pH יש לשמור באופן זהה לחלוטין עבור כל המדידות מאז כל שינוי יכול להיות השפעה חזקה על תכונות הזריחה.
מדידת חיים יכולה גם להיות עדינה. החיים הפלואורסצנטית של התורם יכול להיות לא יציב, למשל בגלל עירור גבוה. במקרה כזה, כוונון כוח הלייזר והזום יכולים לפתור את הבעיה. עוד מקור ידוע של חפצי אמנות במדידות TCSPC הוא הדופק פוטון ערימת. אכן, TCSPC לא יכול למדוד את המהירות של שני פוטונים הנפלטים בין שני פולסים לייזר. בעוד דגימות צמחים מובנים מאוד, הקרינה הפלואורסצנטית אינו הומוגנית והוא עלול להוביל לאפקט מוסתר השרשרת. בעוד מספר הפוטונים לשנייה נשאר מתחת למגבלת 1% עירור, זה יכול להיות גבוה יותר באזורים לדוגמה מסוימים. מדידת החיים הפלואורסצנטית של התורם בשטף פוטון שונה יכול להיחשב. , אם החיים מגדילים בזמן ששטף הזרם יורד. אפקט השרשרת משנה מדידות שטף פוטון אופטימלי מגיע. עם יציבות החיים של התורם
בנוגע לניתוח העקומה של sFLIM, מומלץ להסתמך על כל התאמה של עקומת הפרט כדי להבטיח שהמודל מתאר במדויק את המידות. אם זה לא המקרה, ראשית ודא שאף אחד מחפצי האמנות שהוזכרו בעבר השחית את הנתונים. לאחר מכן, step 2.1.4 מספק את פונקציית התגובה האינסטרומנטלית (IRF) של המערכת. אם IRF מציג מספר חריגות, מטב את הנתיב האופטי כדי למזער אותם. ניתן להשתמש ב-IRF הנמדד לצורך התאמה במהלך שלב 6.2. לבסוף, ניתן להגדיל את דרגות החופש של המודל המתאים לדעיכה בעלת שלושה מעריכי בשלב 6.2. עם זאת, מספר הפוטונים הנדרשים לאורך חיים בודדים וקביעת פרופורציה הוא גבוה, ולכן מומלץ להשתמש בהם רק כדי להשיג חיים יציבים יותר ממוצע משלב 6.4. מידע ממצה נוסף על FLIM, האפיון שלה18, sflim ויישומו12 במיוחד לליגנין10, ניתן למצוא בספרות.
למרות מאתגרת, מדידה של הרקמה ברקמות הצמחים באמצעות המקור האוטומטי מראה כמה יתרונות. בהשוואה למדידות מדידות שבוצעו על רקמות החיים שבו מחקרים אינטראקציה בין biomolecules לעתים קרובות דורש הנדסה גנטית כדי לבטא סמנים פלורסנט מהותי, רקמות הצמח לחיות כמו אלה המוצגים כאן, להציע טבעי פלואורסצנט אוטומטי, ו שותף חיצוני הבדיקות הפלורסנט ניתן להוסיף בקלות, חוסך זמן רב. עם זאת, בהתאם מינים הצמח מנותח ועל הטיפולים מראש אפשרי שבוצעו, המחשב האוטומטי צפוי להיות שונה, כך שהוא צריך להיות מאופיין בזהירות fluorophore המשמש בבדיקות עשוי להיות צורך להתאים.
יש להחיל את שיטת sFLIM על מחלות פלורסנט חסרות פעילות קטליטי (פג ו dextran). במסגרת של ליגנותאית הידרוליזה, אינטראקציות של אנזימים בדגימות ביומסה שונות יכול להתבצע, ואולי כתוצאה מכך קביעת ההשפעה של לוקליזציה (תאים ורקמות) על כוח האינטראקציה. שלב האופטימיזציה הבא יהיה אוטומציה של שלב הניתוח. אכן, עם מספיק נתונים מנותח, ניתוח מבוסס למידה מחשב הליך יכול להיות פרוס עבור ניתוח פנוטיפ אוטומטי, אשר יגביר את היכולת שלה מהירה אנזימים ביומסה יעילות ההקרנה. יתר על כן, sFLIM אינו דורש קיבעון של המדגם והוא יכול להיות בקלות להחיל אנזימים דינמיים-lignin לימודי אינטראקציה. שיטה ייחודית זו עשויה להנחות את אסטרטגיית הנדסת אנזימים וביומסה טרום טיפול כדי לייעל ליגנותאית valorization.
The authors have nothing to disclose.
פאני לורן (מחיר) מודה בחום על הכנת הדמויות. הפדרציה מחקר FRABio (אוניברסיטת ליל, CNRS) הוא הודה לספק את הסביבה הטכנית תורמת להשגת עבודה זו. מימון התקבל מסוכנות המחקר הלאומי הצרפתי (ליגנופרוג פרוייקט ANR-14-CE05-0026).
Confocal microscope | ZEISS | LSM 710 NLO | for confocal imaging |
fine brush | to collect sections | ||
glass vials | for incubations | ||
high precision microscope cover glasses 170+/-5µm n°1,5# | Marienfeld | 0107032 | saled by Dutscher s.a in France |
Infra-red pulsed laser | COHERENT | CHAMELEON VISION | For sample excitation |
Micropipette Research Plus monocanal 20-200µL | Eppendorf | with corresponding tips | |
Micropipette Research Plus monocanal 2-20µL | Eppendorf | with corresponding tips | |
Microscope slides ca. 76 x 26 mm ground edges frosted end | Thermo Fisher Scientific | LR45D | |
microtome blades disposable (pack of 50) | Agar Scientific | T5024 | saled by Oxford Instruments in France |
mPEG-Rhodamine, 10 kDa | Creative Peg Works | PSB-2263 | |
mPEG-Rhodamine, 20 kDa | Creative Peg Works | PSB-22642 | |
mPEG-Rhodamine, 5 kDa | Creative Peg Works | PSB-2264 | |
nail polish | for mounting | ||
pH meter five easy plus | Mettler toledo | FEP20 | with electrode |
poly (ethylene Glycol) average mol wt 1450 | Merck (sigma-Aldrich) | P5402-1kg | for sample embedding |
razor blades, single edges blades, stainless steel, box of 100 | Agar Scientific | T586 | for fragments preparation saled by Oxford Instruments in France |
rotary microtome | Microm Microtech | HM 360 | |
sFLim detector | BECKER-HICKL | SPC 150 | for lifetime acquisition |
sodium dihydrogen phosphate dihydrate NaH2PO4, 2H2O | Merck (sigma-Aldrich) | 71500 | for buffer solution |
sodium phosphate dibasic dihydrate Na2HPO4,2H2O | Merck (sigma-Aldrich) | 30435-1kg | for buffer solution, old reference, the new one is 71643-1kg |
tetramethyl rhodamine isothiocyanate-dextran 10 k Da | Merck (sigma-Aldrich) | R8881-100mg |