यह प्रोटोकॉल एक मूल सेटअप का वर्णन करता है जो सीधे मोटी पौधे के वर्गों में रोडामिन-आधारित फ्लोरोसेंट जांच और लिगिन बहुलक के बीच Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (FRET) का मूल्यांकन करने के लिए स्पेक्ट्रल और फ्लोरेसेंस आजीवन मापन का संयोजन करता है।
लिग्नोसेल्यूलोसिक बायोमास (एलबी) में, एंजाइमों की गतिविधि हाइड्रोलिसिस प्रक्रिया के दौरान लिग्निन के साथ गैर-विशिष्ट बातचीत की उपस्थिति से सीमित होती है, जो एंजाइमों को उनके सब्सट्रेट से दूर रखता है। इन जटिल बातचीत का लक्षण वर्णन इस प्रकार पौंड जैसे जटिल सब्सट्रेट्स में एक चुनौती है। यहां विधि फ्लोरोफोर-टैग किए गए अणुओं और देशी ऑटोफ्लोरोसेंट लिग्निन के बीच आणविक बातचीत को मापता है, जो Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (FRET) द्वारा प्रकट किया जाएगा। दो एक्सोजेनस फ्लोरोफोरस का उपयोग करके जीवित कोशिकाओं में एफआरआई माप के विपरीत, लिग्निन का उपयोग करके पौधों में एफआरआई माप इसके जटिल ऑटोफ्लोरेसेंस के कारण तुच्छ नहीं है। फ्लोरेसेंस उत्सर्जन और जीवनकाल: हमने फ्लोरेसेंस के दो पूरक गुणों के सहसंबद्ध अवलोकन के साथ एक मूल अधिग्रहण और विश्लेषण पाइपलाइन विकसित की है। एसएफआईआईम (स्पेक्ट्रल और फ्लोरोसेंट लाइफटाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी) उच्च संवेदनशीलता के साथ इन बातचीत की मात्रा प्रदान करता है, जिससे बायोमॉलिक्यूल्स और लिग्निन के बीच विभिन्न इंटरैक्शन स्तरों का खुलासा होता है।
ग्लूकोज जैसे मोनोमेरिक शर्करा में हाइड्रोलिजिंग लिग्नोसेल्यूलोज को एंजाइमों की आवश्यकता होती है। उनकी गतिविधि एंजाइमों और लिग्निन1,2के बीच गैर – विशिष्ट बातचीत की स्थापना से संयमित मानी जाती है , बाद में हाइड्रोफोबिक बहुलक और लिग्नोसेल्यूलोस3का एक प्रमुख घटक है । इस प्रकार, सेलुलर पैमाने पर सीधे इस तरह की बातचीत को मापने के लिए मात्रात्मक रूप से एक चुनौती है जिसे एंजाइम उत्प्रेरक गतिविधि और लिगनोसेल्यूलोज प्री-ट्रीटमेंट4को अनुकूलित करने के लिए संबोधित किया जाना चाहिए।
Förster (या फ्लोरेसेंस) अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (FRET) माप सीटू में गधे जैव अणुओं बातचीत के लिए पसंद की एक विधि है। यह गैर रेडिएटिव ऊर्जा हस्तांतरण एक दाता और एक स्वीकारकर्ता फ्लोरोफोर के बीच हो सकता है यदि वे विभिन्न शर्तों को पूरा करते हैं। दाता उत्सर्जन स्पेक्ट्रम को कम से आंशिक रूप से, स्वीकारकर्ताओं को उत्तेजना स्पेक्ट्रम को ओवरलैप करना चाहिए । इस प्रकार इस तरह के प्रयोगों के लिए फ्लोरोफोरस का चुनाव महत्वपूर्ण है। फिर, स्थानांतरण दक्षता उनकी दूरी5 की छठी शक्ति के साथ कम हो जाती है और केवल तभी होती है जब दोनों अणु निकट आस में होते हैं (आमतौर पर नैनोमीटर रेंज में)। अन्य आकस्मिकता डाइपोल-डाइपोल ओरिएंटेशन जैसे हस्तांतरण दक्षता को बदल सकती है लेकिन अगर फ्लोरोफोरस में लचीलापन है तो इसे कम किया जाता है।
एफआरईटी को विभिन्न तकनीकों से मापा जा सकता है और विस्तृत विवरण साहित्य6,7में पाए जा सकते हैं । संक्षेप में, मुख्य विधियां भरोसा करती हैं: i) संवेदनशील उत्सर्जन जिसमें स्वीकार्य उत्सर्जन फ्लोरेसेंस में भिन्नता का पालन किया जाता है और मुख्य रूप से गुणात्मक परिणाम प्रदान करता है; ii) स्वीकारकर्ता फोटोब्लीचिंग जिसमें दाता उत्सर्जन फ्लोरेसेंस को स्वीकारकर्ता फोटोब्लीचिंग से पहले और बाद में मापा जाता है (इस मामले में, अधिक सटीक FRET अनुमान प्राप्त किए जा सकते हैं लेकिन निश्चित नमूनों पर लागू मजबूत लेजर शक्ति की आवश्यकता होती है); और iii) आजीवन माप जो स्वीकारकर्ता की उपस्थिति में दाता के लिए कम हो जाता है। इस विधि के लिए विशिष्ट उपकरणों की आवश्यकता होती है और फ्लोरोफोर्स के बीच सटीक और संवेदनशील बातचीत माप की अनुमति देता है। फ्लोरोसेंट जांच और लिग्नोसेल्यूलोज के बीच एफआरटी माप को ध्यान में रखते हुए, मुख्य कठिनाई यह है कि लिग्नोसेल्यूलोस एक अच्छी तरह से विशेषता फ्लोरोफोर नहीं है: इसमें एक मजबूत देशी और स्पेक्टरैली-व्यापी ऑटोफ्लोरेसेंस है, जो मुख्य रूप से लिग्निन से उत्पन्न होता है, और बायोमास प्रजातियों8,9पर निर्भर करता है।
इस पत्र में, हम लकड़ी/पौधों के नमूनों के वर्गों के अनुकूल एक नई और मूल प्रक्रिया का प्रस्ताव करते हैं । यह एसएफआईएम आधारित विधि देशी लिग्नोसेल्यूलोज नमूनों में फ्लोरोसेंट जांच और लिग्निन के बीच मात्रात्मक एफआरटी मापन का रास्ता खोलती है।
कॉर्परेज़ फ्लोरेसेंस लाइफटाइम और उत्सर्जन स्पेक्ट्रम माप दोनों तरीकों के फायदे को मिलाने की अनुमति देता है। दरअसल, अकेले स्पेक्ट्रल माप न होने से संवेदनशीलता की कमी होती है और गुणात्मक बने रहते हैं । दूसरी ओर, फ्लोरेसेंस लाइफटाइम पारंपरिक मात्रात्मक एफआरटी मापन के लिए पसंद की विधि है, लेकिन यह प्रदर्शित किया गया था कि लिग्निन ऑटोफ्लोरेसेंस लिग्निन संरचना और पर्यावरण16के आधार पर भिन्न हो सकता है। इस प्रकार, एक स्वीकारकर्ता या लिग्निन संरचनात्मक परिवर्तनों के साथ लिग्निन बातचीत में भेदभाव नहीं किया जा सकता है क्योंकि वे दोनों जीवन भर कम हो जाते हैं। जैसा कि प्रदर्शन किया गया है, विकसित विधि पौधों के वर्गों में लिग्निन और स्वीकारकर्ता अणुओं के बीच बातचीत की स्पष्ट, संवेदनशील और मात्रात्मक माप प्रदान करती है। यहां तक कि अगर विधि के विभिन्न चरणों को कड़ाई से अनुकूलित किया गया था, तो निम्नलिखित बिंदुओं के लिए विशेष रूप से सावधानी बरती जानी चाहिए।
नमूनों के बारे में, संयंत्र अनुभाग की गुणवत्ता में ध्यान केंद्रित इमेजिंग सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है । खूंटी एम्बेडिंग के लिए अलग कदम कड़ाई से पालन किया जाना चाहिए। अंतिम वाशिंग कदम के नमूनों में शेष खूंटी से कोई हस्तक्षेप सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है । इसके अलावा, बफर एकाग्रता और पीएच को सभी मापों के लिए कड़ाई से समान रखा जाना चाहिए क्योंकि किसी भी परिवर्तन का फ्लोरेसेंस गुणों पर मजबूत प्रभाव पड़ सकता है।
लाइफटाइम मेजरमेंट भी नाजुक हो सकता है। दाता के फ्लोरेसेंस जीवनकाल अस्थिर हो सकता है, उदाहरण के लिए एक उच्च उत्तेजना की वजह से । ऐसे में लेजर पावर और जूम ट्यूनिंग से इश्यू ठीक हो सकता है। टीसीएसपीसी मापन में कलाकृतियों का एक और प्रसिद्ध स्रोत फोटॉन पल्स पाइल-अप है। दरअसल, टीसीएसपीसी एक ही दो लेजर दालों के बीच उत्सर्जित दो फोटॉनों की गति को माप नहीं सकता है। जबकि पौधों के नमूने अत्यधिक संरचित होते हैं, फ्लोरेसेंस सजातीय नहीं होता है और एक छिपी हुई नाड़ी पाइअप प्रभाव का कारण बन सकता है। जबकि प्रति सेकंड फोटॉनों की संख्या 1% उत्तेजना सीमा से नीचे बनी हुई है, यह कुछ नमूना क्षेत्रों में अधिक हो सकती है। कोई pileup प्रयोगों को सुनिश्चित करने के लिए, एक अलग फोटॉन प्रवाह पर दाता फ्लोरेसेंस जीवनकाल को मापने पर विचार किया जा सकता है । यदि प्रवाह कम होने पर जीवनकाल बढ़ता है, तो एक पाइअप प्रभाव माप में फेरबदल कर रहा है। इष्टतम फोटॉन प्रवाह दाता के जीवनकाल स्थिरता के साथ पहुंच गया है।
sFLIM क्षय वक्र विश्लेषण के बारे में, हम यह सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक व्यक्तिवक्र फिट पर निर्भर करने की सलाह देते हैं कि मॉडल माप का सही वर्णन करता है। यदि यह मामला नहीं है, तो पहले यह सुनिश्चित करें कि पहले उल्लिखित कलाकृतियों में से किसी ने भी डेटा को भ्रष्ट नहीं किया है। फिर, चरण 2.1.4 सिस्टम का इंस्ट्रूमेंटल रिस्पांस फंक्शन (आईआरएफ) प्रदान करता है। यदि आईआरएफ कुछ विसंगतियों को प्रस्तुत करता है, तो उन्हें कम करने के लिए ऑप्टिकल पथ का अनुकूलन करें। चरण 6.2 के दौरान फिटिंग के लिए एक मापा आईआरएफ भी इस्तेमाल किया जा सकता है। अंत में, स्वतंत्रता के फिटिंग मॉडल की डिग्री चरण ६.२ में एक तीन घातीय क्षय करने के लिए बढ़ाया जा सकता है । हालांकि, व्यक्तिगत जीवनकाल और अनुपात निर्धारण के लिए आवश्यक फोटॉनों की संख्या अधिक है और इस प्रकार केवल चरण 6.4 से अधिक स्थिर औसत जीवनकाल प्राप्त करने के लिए उनका उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। FLIM पर अधिक संपूर्ण जानकारी, इसके लक्षण वर्णन18,sFLIM और उसके आवेदन12 विशेष रूप से लिग्निन10के लिए, साहित्य में पाया जा सकता है ।
हालांकि चुनौतीपूर्ण, देशी ऑटोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके पौधों के ऊतकों में FRET माप कुछ फायदे दिखाता है। जीवित ऊतकों पर किए गए FRET माप की तुलना में, जिसमें जैव अणुओं के बीच बातचीत अध्ययन अक्सर आंतरिक फ्लोरोसेंट मार्कर व्यक्त करने के लिए आनुवंशिक इंजीनियरिंग की आवश्यकता होती है, यहां प्रस्तुत लोगों के रूप में लिग्निफाइड पौधे के ऊतकों, प्राकृतिक प्रदान करते हैं ऑटोफ्लोरेसेंस, और बाह्य साथी फ्लोरोसेंट जांच आसानी से जोड़ा जा सकता है, जिससे अधिक समय की बचत होती है। हालांकि, विश्लेषण किए गए पौधों की प्रजातियों के आधार पर और किए गए संभावित पूर्व-उपचारों के आधार पर, ऑटोफ्लोरेसेंस को संशोधित किए जाने की संभावना है, ताकि इसे सावधानीपूर्वक विशेषता और फ्लोरोफोर की आवश्यकता हो क्योंकि जांच को अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है।
एसएफआईएम विधि उत्प्रेरक गतिविधि (खूंटी और dextran) की कमी फ्लोरोसेंट जांच के लिए लागू किया जाना चाहिए। पौधे लिग्नोसेल्यूलोस हाइड्रोलिसिस के फ्रेम में, विभिन्न बायोमास नमूनों में एंजाइमों की बातचीत की जा सकती है, संभवतः बातचीत की ताकत पर स्थानीयकरण (कोशिकाओं और ऊतकों) के प्रभाव का निर्धारण किया जा सकता है। अगला अनुकूलन कदम विश्लेषण चरण का स्वचालन होगा। दरअसल, पर्याप्त विश्लेषण डेटा के साथ, एक मशीन लर्निंग आधारित विश्लेषण प्रक्रिया स्वचालित फेनोटाइप विश्लेषण के लिए तैनात किया जा सकता है, जो तेजी से एंजाइम-बायोमास दक्षता स्क्रीनिंग के लिए अपनी amenability में वृद्धि होगी । इसके अलावा, एसएफआईआईम को नमूने के निर्धारण की आवश्यकता नहीं है और इसे आसानी से गतिशील एंजाइम-लिग्निन इंटरैक्शन अध्ययनों पर लागू किया जा सकता है। इस तरह की अनूठी विधि से लिगनोसेल्यूलोस वीरता को अनुकूलित करने के लिए एंजाइम इंजीनियरिंग रणनीति और बायोमास प्री-ट्रीटमेंट का मार्गदर्शन करने की संभावना है।
The authors have nothing to disclose.
आंकड़ों की तैयारी के लिए फैनी लॉरेंट (किराया) का गर्मजोशी से शुक्रिया अदा किया जाता है । अनुसंधान महासंघ FRABio (लील विश्वविद्यालय, CNRS) तकनीकी इस काम को प्राप्त करने के लिए अनुकूल वातावरण प्रदान करने के लिए स्वीकार किया है । धन फ्रांसीसी राष्ट्रीय अनुसंधान एजेंसी (LIGNOPROG परियोजना ANR-14-CE05-0026) से प्राप्त किया गया था ।
Confocal microscope | ZEISS | LSM 710 NLO | for confocal imaging |
fine brush | to collect sections | ||
glass vials | for incubations | ||
high precision microscope cover glasses 170+/-5µm n°1,5# | Marienfeld | 0107032 | saled by Dutscher s.a in France |
Infra-red pulsed laser | COHERENT | CHAMELEON VISION | For sample excitation |
Micropipette Research Plus monocanal 20-200µL | Eppendorf | with corresponding tips | |
Micropipette Research Plus monocanal 2-20µL | Eppendorf | with corresponding tips | |
Microscope slides ca. 76 x 26 mm ground edges frosted end | Thermo Fisher Scientific | LR45D | |
microtome blades disposable (pack of 50) | Agar Scientific | T5024 | saled by Oxford Instruments in France |
mPEG-Rhodamine, 10 kDa | Creative Peg Works | PSB-2263 | |
mPEG-Rhodamine, 20 kDa | Creative Peg Works | PSB-22642 | |
mPEG-Rhodamine, 5 kDa | Creative Peg Works | PSB-2264 | |
nail polish | for mounting | ||
pH meter five easy plus | Mettler toledo | FEP20 | with electrode |
poly (ethylene Glycol) average mol wt 1450 | Merck (sigma-Aldrich) | P5402-1kg | for sample embedding |
razor blades, single edges blades, stainless steel, box of 100 | Agar Scientific | T586 | for fragments preparation saled by Oxford Instruments in France |
rotary microtome | Microm Microtech | HM 360 | |
sFLim detector | BECKER-HICKL | SPC 150 | for lifetime acquisition |
sodium dihydrogen phosphate dihydrate NaH2PO4, 2H2O | Merck (sigma-Aldrich) | 71500 | for buffer solution |
sodium phosphate dibasic dihydrate Na2HPO4,2H2O | Merck (sigma-Aldrich) | 30435-1kg | for buffer solution, old reference, the new one is 71643-1kg |
tetramethyl rhodamine isothiocyanate-dextran 10 k Da | Merck (sigma-Aldrich) | R8881-100mg |