Generierung einer Leber orthotopischen Human Enuveal Melanom Xenograft Plattform bei immundefizienten Mäusen
Summary
Orthotopische humane Leber metastasierenuvealmelanom xenograft MausModelle wurden mit chirurgischen orthotopischen Implantationstechniken mit Patienten-abgeleiteten Tumorstück und Nadelinjektionstechniken mit kultivierten menschlichen uvealen Melanom-Zelllinien erstellt.
Abstract
In den letzten Jahrzehnten wurden subkutan implantierte, von Patienten abgeleitete Xenograft-Tumoren oder kultivierte menschliche Zelllinien zunehmend als repräsentativere Modelle zur Untersuchung von menschlichen Krebserkrankungen bei immundefizienten Mäusen anerkannt als herkömmliche etablierte menschliche Zellen. Linien in vitro. Kürzlich wurden orthotopisch implantierte Patienten-Xenograft-Modelle (PDX) bei Mäusen entwickelt, um Merkmale von Patiententumoren besser zu replizieren. Ein orthotopisches Xenograft-Mausmodell der Leber soll eine nützliche Krebsforschungsplattform sein, die Einblicke in die Tumorbiologie und die medikamentöse Therapie bietet. Jedoch, Leber orthotopische Tumorimplantation ist in der Regel kompliziert. Hier beschreiben wir unsere Protokolle für die orthotopische Implantation von lebermetastasierten uvealen Melanomtumoren. Wir kultivierten humane Leber metastasieren uveal Melanom Zelllinien in immundefizienten Mäusen. Die Protokolle können zu gleichbleibend hohen technischen Erfolgsraten führen, indem entweder eine chirurgische orthotopische Implantationstechnik mit Stücken von patientenabgeleitetem uvealem Melanomtumor oder eine Nadelinjektionstechnik mit kultivierter menschlicher Zelllinie verwendet wird. Wir beschreiben auch Protokolle für CT-Scans zum Nachweis von inneren Lebertumoren und für Reimplantationstechniken mit kryokonservierten Tumoren, um eine Re-Engraftmentment zu erreichen. Zusammen bieten diese Protokolle eine bessere Plattform für leberorthotopische Tumormausmodelle des lebermetastasieren uvealen Melanoms in der translationalen Forschung.
Introduction
Uvealmelanom ist der häufigste intraokulare maligne Tumor bei Erwachsenen in der westlichen Welt. In den letzten 50 Jahren ist die Inzidenz von uvealem Melanom (5,1 Fälle pro Million) in den Vereinigten Staaten stabil geblieben1,2. Uvealmelanom entsteht durch Melanozyten in der Iris, ziliarkörper, oder Aderhaut, und es ist eine extrem tödliche Krankheit, wenn es Metastasen entwickelt. Die Sterblichkeitsrate von Patienten mit uvealer Melanommetastasierung betrug 80% bei 1 Jahr und 92% bei 2 Jahren nach der Erstdiagnose der Metastasen. Die Zeit zwischen der Diagnose von Metastasen und dem Tod ist in der Regel kurz, weniger als 6 Monate, ohne Bezug auf Therapie3,4. Der Krebs breitet sich durch das Blut aus und neigt dazu, dominant metastasieren in die Leber (89-93%)4,5. Für die weitere Untersuchung des lebermetastasierenden uvealen Melanoms wird dringend ein effektives Mausmodell benötigt. Für die translationale Forschung besteht die klare Forderung, ein leberlokalisiertes metastasierendes uveales Melanom-Mausmodell zu generieren.
Patienten-abgeleitete Tumor-Xenograft-Mausmodelle (PDX) sollen individuelle Medizinstrategien liefern. Diese Modelle könnten prädiktiv für klinische Ergebnisse sein, nützlich für die präklinische Arzneimittelbewertung sein und für biologische Studien vonTumoren6 verwendet werden. Repräsentative PDX-Modelle sind ektopisch tumorimplantierte Xenograft-Mäuse, die Tumor an subkutanen Stellen haben. Die meisten Forscher können Chirurgie für subkutane Implantation ohne spezielle Praxis7,8. Sie können auch subkutane Tumoren leicht überwachen. Obwohl subkutane PDX-Modelle in der Forschungsphase populär wurden, haben sie einige Hürden beim Übergang in die Praxis. Subkutane Implantation zwingt patientenabgeleitete Tumoren, sich in einer anderen Mikroumgebung als dem Tumorursprung zu engrafieren, so dass sie zu Engraftmentversagen und langsamem Tumorwachstum9,10,11, 12,13,14. Orthotopische Engraftment kann ein idealer und rationaler Ansatz für ein PDX-Modell sein, weil es das gleiche Organ wie der ursprüngliche Tumor15,16verwendet.
Kürzlich haben wir Protokolle für chirurgische orthotopische Implantationstechniken von lebermetastasierten uvealen Melanomtumoren und Nadelinjektionstechniken mit einer kultivierten menschlichen lebermetastasieren uvealen Melanom-Zelllinie in NOD entwickelt. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) Mäuse17,18. Die Protokolle führen zu konstant hohen technischen Erfolgsraten. Wir haben auch CT-Scanning-Techniken etabliert, die nützlich sind, um innere Lebertumoren zu erkennen, und wir haben eine Reimplantation von kryokonservierten Tumoren in der PDX-Plattform entwickelt. Wir fanden heraus, dass uveale Melanom-Tumor-Xenograft-Modelle die Eigenschaften des ursprünglichen Lebertumors des Patienten beibehalten, einschließlich ihrer histopathologischen und molekularen Eigenschaften. Zusammen bieten diese Techniken eine bessere Plattform für orthotopische Tumormodelle der Leber für uveales Melanom in der translationalen Forschung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die aktuellen orthotopischen Xenograft-Modelle sind arbeitsintensiv, zeitaufwändig und teuer zu erstellen. Orthotopische Tumor Xenograft Maus Modelle für Leberkrebs wurden vor mehr als zwei Jahrzehnten etabliert19,20,21. Diese Technik ist jedoch kompliziert und erfordert die Verwendung von speziellen Geräten, wie z. B. einem Mikronadelhalter und 6-0 bis 8-0. feine Nähte unter dem Mikroskop. Tumor und normales Lebergewebe mü…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken M. Ohara, K. Saito und M. Terai für die Durchsicht des Manuskripts. Die Autoren würdigen die kritische Überprüfung der redaktionellen und englischen Unterstützung dieses Manuskripts durch Dr. R. Sato am Fox Chase Cancer Center. Die hier beschriebene Arbeit wurde vom Bonnie Kroll Research Fund, dem Mark Weinzierl Research Fund, dem Eye Melanoma Research Fund der Thomas Jefferson University, der Osaka Community Foundation und der JSPS KAKENHI Grant Number JP 18K15596 in Osaka City unterstützt. Universität. Studien im Labor von Dr. A. Aplin wurden durch das NIH-Stipendium R01 GM067893 unterstützt. Dieses Projekt wurde auch durch einen Dean es Transformative Science Award, einen Thomas Jefferson University Programmatic Initiative Award, finanziert.
Materials
| Materials, tissues and animals | |||
| Buprenorphine | |||
| CO2 tank | |||
| Cryomedium | |||
| Exitron nano 12000 (Alkaline earth metal-based nanoparticle contrast agent) | Miltenyl Biotec | 130-095-700 | |
| HBSS 1X, with calcium & magnesium | Corning | 21-020-CM | |
| Human liver metastatic uveal melanoma cell line | |||
| Human uveal melanoma tissue in the liver | All tissue handling should be done in a Biosafety Level 2 hood. Be careful when working with human tissue; always use gloves and avoid direct skin contact. Assume patients may have been infected with HIV or other highly transmissible organisms. Do not process samples known to carry infections. | ||
| Iodine | |||
| Isoflurane | Purdue Products | 67618-150-17 | |
| Isopropanol | Fisher scientific | A416-1 | Avoid direct contact to skin and eye and inhalation of anesthetic agent. |
| Liquid nitrogen | |||
| Matrigel HC | BD | 354248 | |
| NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | Jackson Lab | 5557 | 4 to 8 weeks old |
| PBS 1X, without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CM | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-013-CV | |
| Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol) | Nice-Pak products | B603 | |
| 4% paraformaldehyde phosphate buffer solution | Wako | 163-20145 | |
| 70% Ethyl alcohol solution | Fisher Scientific | 04-355-122 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Absorbable hemostat | Johnson and Johnson | 63713-0019-61 | |
| Autoclave | |||
| Body weight measure | |||
| Cautery | Bovie Medical | MC-23009 | |
| Cell counter | |||
| Centrifuzer | |||
| Cotton swab | |||
| Cryo freezing container | NALGENE | 5100-0001 | |
| Cryotube | SARSTEDT | 72.379 | |
| Curved scissors | World Precision Instruments | 503247 | |
| Curved ultrafine forceps | World Precision Instruments | 501302 | |
| Fabric sheet | |||
| Freezer | |||
| F/AIR Filter Canister | Harvard Apparatus | 600979 | |
| Heating pad | |||
| Isoflurane vaporizer | Artisan Scientific | 66317-1 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Liquid nitrogen jar | Thermo Fisher Scientific | 2123 | |
| Micro-CT scan | Siemens | ||
| Needle holder | World Precision Instruments | 501246 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Pipette | |||
| Spray bottle | |||
| Sterile hood | Biosafety level 2 cabinet | ||
| Sterile No.11 scalpel | AD Surgical | A300-11-0 | |
| Straight forceps | World Precision Instruments | 14226 | |
| Surgical drape | |||
| Tail vein restrainer | Braintree Scientific | TV-150-STD | |
| Water bath | |||
| 1 ml TB syringe with 27-gauge needle | BD | 309623 | |
| 1.7 ml tube | Bioexpress | C-3260-1 | |
| 5-0 PDO Suture | AD Surgical | S-D518R13 | |
| 15 mL conical tubes | AZER SCIENTIFIC | ES-9152N | |
| 27-gauge needle | BD | 780301 | |
| 27-gauge needle | Hamilton | 7803-01 | |
| 50 mL conical tubes | AZER SCIENTIFIC | ES-9502N | |
| 50 µl micro syringe | BD | 80630 | |
| 50 µl micro syringe | Hamilton | 7655-01 | |
| 100 mL container | Fisher Scientific | 12594997 | |
| 200μl tip |
References
- Aronow, M. E., Topham, A. K., Singh, A. D. Uveal Melanoma: 5-Year Update on Incidence, Treatment, and Survival (SEER 1973-2013). Ocular Oncology and Pathology. 4 (3), 145-151 (2018).
- Krantz, B. A., Dave, N., Komatsubara, K. M., Marr, B. P., Carvajal, R. D. Uveal melanoma: epidemiology, etiology, and treatment of primary disease. Clinical Ophthalmology. 11, 279-289 (2017).
- Gragoudas, E. S., et al. Survival of patients with metastases from uveal melanoma. Ophthalmology. 98 (3), 383-389 (1991).
- Diener-West, M., et al. Development of metastatic disease after enrollment in the COMS trials for treatment of choroidal melanoma: Collaborative Ocular Melanoma Study Group Report No. 26. Archives of Ophthalmology. 123 (12), 1639-1643 (2005).
- Collaborative Ocular Melanoma Study Group. Assessment of metastatic disease status at death in 435 patients with large choroidal melanoma in the Collaborative Ocular Melanoma Study (COMS): COMS report no. 15. Archives of Ophthalmology. 119 (5), 670-676 (2001).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Kim, M. P., et al. Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice. Nature Protocols. 4 (11), 1670-1680 (2009).
- Némati, F., et al. Establishment and characterization of a panel of human uveal melanoma xenografts derived from primary and/or metastatic tumors. Clinical Cancer Research. 16 (8), 2352-2362 (2010).
- Wilmanns, C., et al. Modulation of Doxorubicin sensitivity and level of p-glycoprotein expression in human colon-carcinoma cells by ectopic and orthotopic environments in nude-mice. International Journal of Oncology. 3 (3), 413-422 (1993).
- Kang, Y., et al. Proliferation of human lung cancer in an orthotopic transplantation mouse model. Experimental and Therapeutic. 1 (3), 471-475 (2010).
- Fichtner, I., et al. Establishment of patient-derived non-small cell lung cancer xenografts as models for the identification of predictive biomarkers. Clinical Cancer Research. 14 (20), 6456-6468 (2008).
- Marangoni, E., et al. A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays. Clinical Cancer Research. 13 (13), 3989-3998 (2007).
- Bergamaschi, A., et al. Molecular profiling and characterization of luminal-like and basal-like in vivo breast cancer xenograft models. Molecular Oncology. 3 (5-6), 469-482 (2009).
- Ho, K. S., Poon, P. C., Owen, S. C., Shoichet, M. S. Blood vessel hyperpermeability and pathophysiology in human tumour xenograft models of breast cancer: a comparison of ectopic and orthotopic tumours. BMC Cancer. 12, 579 (2012).
- Hoffman, R. M. Patient-derived orthotopic xenografts: better mimic of metastasis than subcutaneous xenografts. Nature Reviews Cancer. 15 (8), 451-452 (2015).
- Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 85 (2), 217-221 (2009).
- Ozaki, S., et al. Establishment and Characterization of Orthotopic Mouse Models for Human Uveal MelanomaHepatic Colonization. American Journal of Pathology. 186 (1), 43-56 (2016).
- Kageyama, K., et al. Establishment of an orthotopic patient-derived xenograft mouse model using uveal melanomahepatic metastasis. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 145 (2017).
- Fu, X. Y., Besterman, J. M., Monosov, A., Hoffman, R. M. Models of human metastatic colon cancer in nude mice orthotopically constructed by using histologically intact patient specimens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (20), 9345-9349 (1991).
- Rashidi, B., et al. An orthotopic mouse model of remetastasis of human colon cancer liver metastasis. Clinical Cancer Research. 6 (6), 2556-2561 (2000).
- Fan, Z. C., et al. Real-time monitoring of rare circulating hepatocellular carcinoma cells in an orthotopic model by in vivo flow cytometry assesses resection on metastasis. Recherche en cancérologie. 72 (10), 2683-2691 (2012).
- Jacob, D., Davis, J., Fang, B. Xenograftictumor modelsinmiceforcancer research, atechnical review. Gene Therapy and Molecular Biology. 8, 213-219 (2004).
- Ahmed, S. U., et al. Generation of subcutaneous and intrahepatic human hepatocellular carcinoma xenografts in immunodeficient mice. Journal of Visualized Experiments. 25 (79), e50544 (2013).
- Kim, M., et al. Generation of humanized liver mouse model by transplant of patient-derived fresh human hepatocytes. Transplantation Proceedings. 46 (4), 1186-1190 (2014).
- Lavender, K. J., Messer, R. J., Race, B., Hasenkrug, K. J. Production of bone marrow, liver, thymus (BLT) humanized mice on the C57BL/6 Rag2(-/-)γc(-/-)CD47(-/-) background. Journal of Immunological Methods. 407, 127-134 (2014).
- Boll, H., et al. Micro-CT based experimental liver imaging using a nanoparticulate contrast agent: a longitudinal study in mice. PLoS One. 6 (9), e25692 (2011).
- Zhao, X., et al. Global gene expression profiling confirms the molecular fidelity of primary tumor-based orthotopic xenograft mouse models of medulloblastoma. Neuro-Oncology. 14 (5), 574-583 (2012).
- Rubio-Viqueira, B., et al. An in vivo platform for translational drug development in pancreatic cancer.Clinical. Recherche en cancérologie. 12 (15), 4652-4661 (2006).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Recherche en cancérologie. 73 (17), 5315-5319 (2013).
- Alkema, N. G., et al. Biobanking of patient and patient-derived xenograft ovarian tumour tissue: efficient preservation with low and high fetal calf serum based methods. Scientific Reports. 6 (5), 14495 (2015).
